Förderschwerpunkt Biotechnologie: Umwelt- und ressourcenschonende biotechnologische Produktion verzweigtkettiger Aminosäuren als pharmazeutische Wirkstoffe durch Entwicklung von Hochleistungsproduktionsstämmen des Bakteriums Corynebacterium glutamicum und integrierte umweltentlastende Produktaufarbeitungs-Strategie

Aktenzeichen 13158/01
Zusammenfassung / Abstract: Dateigröße: 0.05 MB | Zuletzt geändert: 11.08.2009
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Projektträger: Amino GmbH
An der Zucker-Raffinerie 9
38373 Frellstedt
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Telefon: 05355/9100-10
Internet: http://www.aminoactives.com
Bundesland: Niedersachsen
Beschreibung:
Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Aminosäuren sind wirtschaftlich wertvolle Produkte. Dies gilt insbesondere für die eng verwandten verzweigtkettigen Aminosäuren L-Leucin, L-Isoleucin und L-Valin, deren Herstellung einer besonders großen Wertschöpfung unterliegt, und die unter anderem für pharmazeutische Zwecke in allerhöchster Rein-heit benötigt werden. Es ist deswegen das Ziel, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem ausschließlich eine der genannten Aminosäuren gebildet wird, ohne dass andere Aminosäuren oder weitere Nebenprodukte gebildet werden. Dadurch sind erheblich einfachere und somit umwelt- und ressourcenschonendere Aufarbeitungsverfahren nötig,
um das reine Endprodukt zu erhalten.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenEin großer Teil der Aminosäuren wird weltweit mit dem Bakterium Corynebacterium glutamicum hergestellt. Dabei spielen Transaminasen bei der Umwandlung der jeweiligen Ketosäure zur Aminosäure eine wesentliche Rolle. Eine Besonderheit der Transaminasen ist aber häufig ihre geringe Spezifität, sodass in bestimmten Fällen, wie z. B. der L-Leucinsynthese sich L-Valinbildung bislang kaum vermeiden lässt. Es sollen deswegen zunächst alle aus dem Genom bekannten Transaminasen von C. glutamicum als re-kombinante Proteine isoliert werden, um ihre Spezifität in vitro mit den verschiedenen Ketosäuren zu bestimmen. Anschließend soll eine Transaminase ausgewählt werden, um sie zu mutagenisieren und durch ein aufzubauendes in vivo Selektionssystem zusammen mit einem High Troughput Screening ein Mutein zu erhalten, das bevorzugt nur eine der drei Ketosäuren zur gewünschten Aminosäure animiert. Dieses Mutein wird biochemisch charakterisiert und zum metabolic engineering verbesserter Stämme eingesetzt. Anschließend wird deren Eignung in Fermentationen geprüft, wobei besonderes Augenmerk auf die angestrebte vereinfachte und somit weniger umweltbelastende Aufarbeitung gelegt wird. Des Weiteren wird gezielt durch Bestimmung der Kristallstruktur und ortsgerichteter Mutagenese der Transaminase IlvE der Einfluss auf ein umweltschonenderes Aufarbeitungsverfahren geprüft.


Ergebnisse und Diskussion

Es wurden zwanzig Proteine mit Transaminasemotiv aus Corynebacterium glutamicum isoliert und teilweise charakterisiert. Dabei wurden die Transaminasen AroT und HisC identifiziert, von denen wir feststellen konnten, dass sie als Nebenaktivität auch die Synthese der verzweigkettigen Aminosäure L Leucin katalysieren. Durch gerichtete Enzymevolution konnte ein AroT-Mutein mit der Mutation M54L gewonnen werden, welches die L-Leucinvorstufe 2-Ketoisocapronsäure mit nahezu verdoppelter katalytischer Effizienz von 59 M-1 s-1 umsetzt. Eine weitere Verbesserung, die die Nutzung eines Muteins zur ausschließlichen Synthese von L-Leucin möglich machen würde, gelang aber nicht. Demgegenüber konnte aber die L-Histidinol-phosphat-Transaminase HisC kristallisiert werden, und es wurde ein Strukturmodell mit einer Auflösung von 1,8 Å bestimmt. Dieses Modell gab in Verbindung mit Mutationen im aktiven Zentrum Aufschluss über die an der Katalyse beteiligten Aminosäurereste, sodass auch hier Potenzial besteht, das Enzym weiter zu verbessern, um die spezielle Bildung einer der verzweigtkettigen Aminosäuren zu erreichen. Im Projekt ursprünglich nicht vorgesehen, aber sehr erfolgreich, war die Verringerung des Nebenprodukts L-Alanin um bis zu 75 % bei der L-Valinbildung mit Corynebacterium glutamicum. Dies gelang durch Deletion der Gene der Transaminase C und der L-Alanin-Transaminase in einem L-Valin-Produktionsstamm.
Durch die Verbesserung des L-Valin akkumulierenden Stammes, konnte das Aufreinigungsverfahren erheblich optimiert werden. Durch die daraus resultierende Einsparung eines zweiten Aufreinigungsschrittes im Aufarbeitungsprozess kann bis zu 30 % weniger Wasser und 25 % weniger Energie eingesetzt werden. Da zusätzlich auch eine gesteigerte Produktausbeute von ca. 15 % erreicht werden konnte wirkt sich die optimierte Zuckerverwertung nicht nur kostengünstig, sondern auch umweltschonend durch Einsparung von Ressourcen aus. Als weitere Verbesserung im Downstreamprocessing konnte ein innovatives Extraktionsverfahren im Technikumsmaßstab demonstriert werden, wobei durch Einsatz minimaler Mengen Chemikalien die Umweltbelastung nachhaltig vermindert werden kann.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

- Marienhagen J, Sandalova T, Eggeling L, Sahm H, Schneider G (2008) Insights into the structural basis of substrate recognition by histidinol-phosphate aminotransferase from Corynebacterium glutamicum. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 64:675-85
- Marienhagen J, Eggeling L (2008) Aminotransferases AlaT and AvtA of Corynebacterium glutami-cum: Metabolic Function and Impact on L-Valine Production. Appl. Environ. Microbiol.(submitted)
- Marienhagen J, Eggeling L, Sahm H (2006) Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien. WO Patentanmeldung CT/DE2006/000685 vom 20.04.2006
- Marienhagen J, Sahm H, Eggeling L (2006) Untersuchungen zur Struktur und Funktion von Transaminasen aus Corynebacterium glutamicum. Perspectives 2006, Düsseldorf
- Marienhagen J, Sandalova T, Eggeling L. Schneider G. (2007) Functional Analysis of all Aminotransferase Proteins of Corynebacterium glutamicum. VAAM 2007, Osnabrück
- Marienhagen J, Eggeling L (2007) Structure and Function of Transaminases of Corynebacterium glu-tamicum. VAAM 2008, Frankfurt


Fazit

Durch die Arbeiten ist es gelungen, einen umfassenden Einblick in die Funktion und Bedeutung einzelner Transaminasen für die Aminosäurebildung mit Corynebacterium glutamicum zu gewinnen. Es gelang die Substratspezifität der Transaminase AroT zu verändern und die Kristallstruktur der Transaminase HisC zu bestimmen. Ferner gelang es durch genetische Arbeiten zwei Transaminasen auszuschalten und dadurch einen L-Valin Produktionsstamm erheblich zu verbessern. Indem die L-Valinausbeute erhöht wird und zudem weniger von der Begleitaminosäure L-Alanin gebildet wird, ist ein erheblich einfacheres und somit umwelt- und ressourcenschonenderes Aufarbeitungsverfahren erforderlich, um das reine Endprodukt L-Valin in Infusionsqualität zu gewinnen

Förderzeitraum: 01.01.2006 - 31.03.2008 (2 Jahre und 3 Monate)
Fördersumme: 270.090,00
Förderbereich: II.4.3
Themengebiet: Umweltforschung
Stichworte: Umweltforschung, Klimaschutz, Umwelttechnik
Publikationen:
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