Projekt 13059/01

Förderschwerpunkt Biotechnologie: Detektion von Mykotoxinen durch Plantibodies

Projektträger

Universität HannoverLehrgebiet Molekulargenetik
Herrenhäuser Str. 2
30419 Hannover
Telefon: 0511/762-4037

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Mykotoxine sind hochgiftige Kontaminationen sekundärer Stoffwechselprodukte bestimmter Schimmelpilze in Lebens- und Futtermitteln. Sie stellen eine große Gefährdung des Verbrauchers dar. Daher kommt ihrem Nachweis eine zentrale Bedeutung im Bereich Lebensmittelsicherheit zu.
Im vorliegenden Projekt sollten innovative Agenzien entwickelt werden, welche für die Detektion von Mykotoxinen verwendet werden können. Dabei handelt es sich um sog. Plantibodies (in Pflanzen produzierte rekombinante Antikörperfragmente).


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenIn Rahmen des Projekts sollten rekombinante Antikörper (scFvs) gegen fünf verschiedene Mykotoxine hergestellt werden: Fumonisin B1 (FB1), Ochratoxin A (OTA), Aflatoxin B1/M1 (AFL), Nivalenol (NIV) und Deoxynivalenol (DON). So genannte scFvs stellen eine Alternative zu klassischen Antikörpern dar. Sie werden in einem System aus Phagen und Bakterien aus scFv-Banken selektiert und anschließend in Bakterien (scFvs) oder auch Pflanzen (Plantibodies) hergestellt.
Zunächst wurde für jedes Mykotoxin mindestens eine Kopplungsstrategie entwickelt, da die Immobilisierung der Haptene für die weiteren Schritte unumgänglich war. Dabei wurden verschiedene Immobilisie-rungsmethoden eingesetzt, von denen sich die Biotin-vermittelte Kopplung als die Geeignetste erwies. Anschließend wurde die eigentlich Selektion (Panning) durchgeführt. Weitere Schritte waren die molekulare Charakterisierung der erhaltenen Klone auf DNA-Ebene und die Bestimmung deren Expressionsverhaltens. Es wurde auf verschiedene Arten die Bindungseigenschaften der scFvs ermittelt (ELISA, Oberflächenplasmonresonanz). Gegen Ende des Projekts wurde mit der Affinitätsreifung einzelner scFvs begonnen, um die zunächst niedrige Avidität zu erhöhen. Parallel zu diesen Arbeiten wurden erste scFv-Gene über Agrobakterienvermittelten Gentransfer in Tabakpflanzen eingebracht und Plantibodies produziert.


Ergebnisse und Diskussion

Zunächst musste für jedes Mykotoxin eine geeignete Kopplungschemie entwickelt werden. Es wurden verschiedene Trägermaterialien getestet, um herauszufinden, welches am besten geeignet ist. Eingesetzt wurden Magnetic Beads und Biotinvermittelte Immobilisierungen sowie ein Zellulosederivat, welches sich aber als unbrauchbar erwies. Die Beads stellten sich als nachteilig heraus, da sie ein kompli-ziertes Handling erfordern und nicht in den nachfolgenden Biacore-Bindungsanalysen eingesetzt werden konnten. Die besten Ergebnisse lieferte die Kopplung an Biotin-Derivate, welche in vielen Fällen zur Iso-lation von scFvs führte.
Auf Basis dieses Systems wurde gegen alle im Rahmen des Projekts zu bearbeitenden Mykotoxine Panningverfahren durchgeführt. Für einige Mykotoxine zeigte sich später, dass die gewählte Kopplungschemie nicht geeignet war, z. B. für die OTA-Biotin- oder die NIV-Epoxy-Kopplung. Solche Versuchsreihen wurden daher nicht weiter verfolgt. Erfolgreich waren die Panningverfahren gegen FB1-Magnetic Beads, FB1-Biotin, NIV-Biotin und Aflatoxin-BSA. Molekularbiologische Analysen zeigten, dass die erhaltenen scFvs -wie erwartet - recht homogen waren. Die Backbone-Sequenzen enthielten nur wenige Mutationen, die Unterschiede liegen tatsächlich nur in den CDR3, also den Regionen, die direkt im Kon-takt mit dem Antigen stehen.
Nach der Subklonierung in bakterielle Expressionsstämme wurden verschiedene Aufreinigungsverfahren entwickelt und verwendet: Kovalent gebundene 6x-His Tag Matrizes (Frenzel et al., 2003) sowie Protein A Affinitätschromatographie.
Die Charakterisierung der Bindungseigenschaften der scFvs wurde in der Regel über Oberflächen-Plasmon Resonanz durchgeführt, weil hier die Affinität getrennt von der Avidität betrachtet werden konnte. Alternativ kam ein modifizierter ELISA bei einigen scFvs zum Einsatz. Es zeigte sich, dass übliche kompetitive ELISA-Systeme, wie sie für klassische Antikörper z. B. bei R-Biopharm eingesetzt werden, nicht für scFvs im gegenwärtigen Stadium geeignet sind. Die niedrige Avidität (auf die in keinem Schritt des Verfahrens hin selektiert wurde) ist verantwortlich für das schlechte Bindungsverhalten in Standard-ELISAs und erfordert nachfolgende Mutageneseverfahren. Hier wurden verschiedene Verfahren getestet und schließlich die SOE PCR (Splicing by Overlap Extension) als die am besten geeignete Methode e-tabliert. Derzeit werden die mutagenesierten scFv-Gene in Phagen eingebracht, um eine Affinitätsreifung durchzuführen (diese Arbeiten wurden nach Abschluss des Projekts am LGM begonnen). Als ein Proof of Principle wurden nicht affinitätsgereifte Antikörpergene (als scFv) des Klons scFv-BFB1_02 (Lauer et al., 2005) in Tabakpflanzen eingebracht, die nun diesen scFv als Plantibody exprimieren. Es wurde ge-zeigt, dass der extra für das Projekt konstruierte, binäre Vektor für die Herstellung von Plantibodies gut geeignet ist. Als besonders vorteilhaft erwies sich letztendlich der Verzicht auf virale Sequenzen im Vek-tor, denn parallel durchgeführte Transformationen mit einem analogen Vektor, der jedoch virale Promo-tersequenzen enthielt (pGI-scFv-General), zeigten, dass die Vitalität der Pflanzen ohne virale Sequen-zen viel höher war. Auch diese Arbeiten werden natürlich mit den mutagenisierten scFvs fortgesetzt.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Das Projekt und die erzielten Ergebnisse wurde mehrfach der Öffentlichkeit vorgestellt: Tagung in Freiburg (2002); Reck et al.: Transkript 10.2003; Frenzel et al.: J. Chromatogr. 2003 (Methode im Rahmen des Projekts entwickelt); Reinard: Bioforum 12.2004; Lauer et al., 2005 J. Agric. Food Chem.


Fazit

Die Produktion rekombinanter Antikörpern und Plantibodies gilt als eine Schlüsseltechnologie für die nächsten Jahre, insbesondere wegen des enorm steigenden Bedarfs an Antikörpern. Während bakteriell produzierte scFv gegen Antigene schon von einigen Arbeitsgruppen im Labormaßstab produziert worden sind (allerdings kaum scFvs, die gegen Haptene gerichtet sind), gibt es noch wenig Erfahrungen mit der großtechnischen Produktion von Plantibodies aus Pflanzen. Daher wird die direkte wirtschaftliche Umsetzung noch einige Zeit in Anspruch nehmen. Die prinzipielle Machbarkeit von scFv für Mykotoxine als Haptene konnte im Rahmen des vorliegenden Projekts am Beispiel von Fumonisin B1 gezeigt werden. Für einen kommerziellen Einsatz sind weitere Arbeiten zum Beispiel hinsichtlich der Verbesserung der Affinität notwendig (Lauer et al., 2005). Die begonnenen Arbeiten werden auch nach Abschluss der Förderphase konzertiert weitergeführt.