Projekt 13007/01

Förderschwerpunkt Biotechnologie: Innovative Entwicklung und halbtechnische Produktion von Dextranase und Laevanase zum ressourcenschonenden und abfallvermeidenden Einsatz in Extraktionsanlagen der Zuckerindustrie

Projektträger

Nordzucker AGManager Produktentwicklung & Technischer Service
Langer Kamp 5
38106 Braunschweig
Telefon: 0531/38009-70

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Zuckerrüben unterliegen nach Frostschädigung in Abhängigkeit von der Lagertemperatur mikrobiellen Veränderungen. Die dabei auftretende Dextranbildung stört den Zuckergewinnungsprozess, insbesondere die Filtrationsschritte, erheblich. Durch Einsatz von Dextranase lässt sich die Verarbeitungsleistung halten und die durch die fortschreitende Minderung der Rohstoffqualität auftretenden Effekte bezüglich Energie- und Ressourcenverbrauch minimieren. Die zurzeit zugänglichen Dextranasen sind jedoch auf Grund ihrer geringen Aktivität bzw. schnellen Inaktivierung bei üblichen Prozesstemperaturen nur bedingt geeignet. Zielsetzung des Vorhabens war, Vorarbeiten zur Herstellung einer für die Belange der Zuckerindustrie maßgeschneiderten Dextranase durchzuführen.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie gewählten Arbeitsschritte lassen sich in drei Gruppen unterteilen:
1. Selektion und klassische Mutagenese: Screening nach Dextranase-produzierenden Mikroorganismen (Proben aus einer Zuckerfabrik), Auswahl des Stamms, Anzucht von Chaetomium gracile, Mutagenese, Medienoptimierung.
2. Gentechnologische Arbeitsweise: Herstellung von Dextranase-positiven Klonen ausgehend von dem thermophilen Dextranase exprimierenden Thermoanaerobacterium FH1 bzw. von 4 Umweltgenbanken: Isolation und Reinigung der DNA, Klonierung in E. coli, Charakterisierung und Anlegen einer Gesamtgenbank, Screening auf Dextranase.
3. Prüfung von Dextranasepräparaten auf ihre Eignung zum Einsatz in der Zuckerindustrie: Vergleichende Messung der Aktivität durch Beobachtung der Bildung reduzierender Zucker aus Dextran und durch Beobachtung der Viskositätsabnahme in einer Dextranlösung nach Enzymzusatz, Simulation des Prozessschritts Saftreinigung im Labor, Prüfung auf unerwünschte Nebenaktivitäten.


Ergebnisse und Diskussion

Selektion und Mutagenese
In Flüssigkultur zeigte C. gracile eine deutlich höhere Dextranase-Bildung im Vergleich zu den zwei nach dem Screening ausgewählten Mikroorganismen. Daher wurde C. gracile für die weiteren Mutations- und Optimierungsarbeiten ausgewählt. Es gelang, eine Mutante zu isolieren, deren Wachstum auf der Blue-Dextran-Agarplatte eine erhöhte Dextranasebildung im Vergleich zum Wildstamm erwarten ließ. Zur Fermentation mit dieser Mutante wurde eine Medienoptimierung durchgeführt. Besondere Aufmerksamkeit wurde dabei dem Einsatz von Stressfaktoren und der Vermeidung von Dextran als Substratbestandteil gewidmet. Als Stressfaktoren erwiesen sich Kalium- und Natriumchlorid als die wirksamsten Mittel zur Erhöhung der Enzymausbeuten. Beide Substanzen führten nach der Zugabe nach drei Tagen Wachstum zu einer Ausbeuteerhöhung um den Faktor 1,5 bis 2. Auf Dextran als Substratbestandteil konnte jedoch nicht verzichtet werden. Die über diesen Weg gewonnene Dextranase zeigte im Vergleich zu zwei kom-merziell erhältlichen Präparaten sehr ähnliche Eigenschaften bezüglich Temperaturoptimum und -stabilität sowie Aktivität bei Bedingungen, die den technischen möglichst weit angenähert wurden. Auch in einer simulierten Saftreinigung erwiesen sich die Präparate in gleicher Weise geeignet, Dextran abzubauen um Filtrationsprobleme zu vermeiden. Störende Nebenaktivitäten (Saccharose-, Pektinabbau) wurden nicht festgestellt.
Gentechnologische Arbeiten
Es wurden etwa 20.000 rekombinante E. coli-Stämme mit Inserts aus FH1-DNA getestet. Dies entspricht statistisch einer zu 99,99 % vollständigen Genbank. Es konnte jedoch noch kein Dextranase-positiver Klon identifiziert werden. Ein Grund für den bisher mangelnden Erfolg liegt wahrscheinlich darin, dass die verwendete Screeningmethode auf der Produktion von aktiver Dextranase in E. coli beruht. Es ist möglich, dass die Dextranase aus FH1 nur gering oder überhaupt nicht von E. coli ohne weitere genetische Manipulationen produziert werden kann. Alternativ zu der beschriebenen Screeningmethode wollten wir daher eine Identifizierung des Dextranase-Gens aus FH1 in den angelegten Genbanken durch Koloniehybridisierung vornehmen. Als heterologe DNA-Sonden wurden bereits beschriebene Dextranase-Gene verwendet. Mit diesen Sonden zeigten sich keine Signale mit der chromosomalen FH1-DNA. Diese Sonden sind daher für einen Einsatz in einer Koloniehybridisierung ungeeignet. Etwa 560.000 E. coli-Klone aus Standortgenbanken wurden auf die Anwesenheit von Genen für thermostabile Dextranasen durchmustert. Hierbei wurden bisher 5 positive E. coli-Klone identifiziert. Aus diesen wurden die rekombinanten Plasmide isoliert und zur Bestätigung des Dextranase-positiven Phänotyps retransformiert. Zur Identifizierung der Dextranase-Gene werden die Inserts dieser Plasmide sequenziert und die entsprechenden Gene subkloniert. Parallel zu diesen Arbeiten wurde mit FH1 fermentiert, um FH1-Dextranase auf ihre Eigenschaften zu untersuchen. Es wurde ein Präparat mit sehr geringer Enzymaktivität hergestellt, dass sich jedoch als temperaturstabil erwies.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Ein Teil der hier beschriebenen Ergebnisse über die Isolierung und Charakterisierung des Dextranase-Produzenten FH1 wurde im März 1999 im Rahmen der Jahrestagung der VAAM (Vereinigung für Allgemeine und Angewandte Mikrobiologie) in Form eines Posters präsentiert. Anlässlich der Biotechnica in Hannover (5. Bis 7.10.1999) wurden das Projektkonzept und Teilergebnisse im Rahmen eines Vortrags vorgestellt. Eine Publikation über diese Ergebnisse ist ebenfalls in Vorbereitung.


Fazit

Die Zielsetzung, ein Dextranasepräparat bereitzustellen, dass höhere Stabilität bei technischen Bedingungen aufweist als die bisher technisch zugänglichen Präparate, ist nicht erfüllt. Dazu müsste das Enzym aus C. gracile auf gentechnischem Weg modifiziert werden. Das FH1-Enzym zeigte die gewünschte Temperaturstabilität; sein Gen konnte jedoch in E.coli-Klonen nicht identifiziert werden. Andere methodische Ansätze müssen gefunden werden. Ob über die aus den Umweltgenbanken identifizierten Dextranasegene ein Dextranasepräparat mit gewünschten Eigenschaften zugänglich sein wird, kann nur nach Weiterführung der Arbeiten entschieden werden.