Projekt 11319/01

Substitution radioaktiver Isotope: Neuartiges, hochsensitives Fluoreszenz-DNA-/RNA-Footprinting mit Hilfe eines automatischen DNA-Sequenziergeräts

Projektträger

LAROVA Biochemie GmbHHaus E
Kantstr. 55
14513 Teltow
Telefon: 03328/3956-0

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Die Steuerung einer Vielzahl fundamentaler Prozesse in der lebenden Zelle beruht auf der spezifischen Wechselwirkung von Proteinen mit entsprechenden Zielregionen auf der DNA. Beispiele sind die Weiterleitung äußerer Reize in die Zelle (Signaltransduktion) und das zielgerichtete An- und Abschalten bestimmter Gene (Genregulation). Auch das Verständnis einiger Mechanismen der Tumorentstehung sind das Ergebnis der Analyse spezifischer Interaktionen zwischen DNA-bindenden Proteinen und ihren Zielsequenzen auf der DNA. Neben physikalischen Methoden, wie der Röntgenstrukturanalyse, Neutronenstreuung oder Elektronenmikroskopie ist das so genannte Footprinting eine hochauflösende Methode, um die spezifische Bindungsregion eines Proteins auf der DNA zu bestimmen. Ziel des Projekts ist es, in einem neuen Verfahren Footprint-Analysen mit einer nicht-radioaktiven Technologie unter Verwendung von Nahinfrarot (NIR)-Fluoreszenzmarkern auf einem automatisierten DNA-Sequencer durchzuführen. Diese Methode soll als vollständiges System mit allen notwendigen Komponenten für den Verbraucher im Forschungslabor kommerzialisiert werden.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenEtablierung der DNA-Footprinting-Technik auf dem LI-COR Sequencer anhand eines bewährten DNA-Protein-Bindungssystems: DNA-Protein-Interaktion und DNA-Fragmentierung, anschließend lineare Amplifikation und Gelelektrophorese zwecks Auswertung. Die Methode sollte zunächst mit Hilfe eines in Footprints gut charakterisierten DNA-Protein-Bindungssystem (Nuklearfaktor 1; NF I) entwickelt werden, später sollten auch die Modellsysteme des Tet-Repressors und -operators sowie des Transkriptionsfaktors NF-KB (Untereinheit P50) herangezogen werden.


Ergebnisse und Diskussion

Im ersten Schritt wurde das Protein mit seiner entsprechenden Ziel-DNA für 30 Minuten inkubiert. Anschließend wurde die DNA enzymatisch (DNase I) oder chemisch (DMS) verdaut. Durch geeignete Konzentrationen bzw. Inkubationszeiten musste sichergestellt werden, dass die DNA statistisch nur einmal pro Strang geschnitten wurde. Im Bereich der Protein-DNA-Interaktion ist die Nukleinsäure vor der Spaltung geschützt, so dass im Vergleich zur Referenzprobe ohne Protein entsprechende Nukleinsäurefragmente nicht auftreten. Diese Unterschiede in der DNA-Molekulargewichts-Längen-Leiter wurden durch lineare Amplifikation aufgespürt. Dabei binden mit einem NIR-Fluoreszenzfarbstoff markierte Primer an die DNA und verlängern diese bis zur Stelle der Protein-DNA-Wechselwirkung. An dieser Stelle bricht die Polymerisation ab. Die Produkte dieser Reaktion werden auf einem automatischen DNA-Sequenziergerät, welches in vielen Labors etabliert ist (LI-COR DNA-Sequenzierer) der Größe nach aufgetrennt und analysiert. Zur Auswertung der Ergebnisse mussten zuvor die geeigneten Laufbedingungen am LI-COR-Sequenzierer sowie die optimalen Primer- und DNA-Mengen (jeweils 100 Femtomol; fmol) ermittelt werden. Bereits mit einmaliger Verlängerung der Nukleinsäuren konnten scharfe Banden und reproduzierbare Signalintensitäten im Gel beobachtet werden. Die Ergebnisse waren mit denjenigen der radioaktiven Techniken vergleichbar oder sogar besser.
Für ausreichend starke Signale waren unter den bisherigen Bedingungen bei der nichtradioaktiven Methode 100 fmol DNA notwendig. Das entspricht der 10-20fachen Menge des herkömmlichen radioaktiven Verfahrens. Bei der späteren praktischen Anwendung des Verfahrens ist das DNA-bindende-Protein der limitierende Faktor. Da es nicht immer kloniert ist und häufig in der Zelle in nur sehr geringen Mengen vorliegt, so dass dessen Isolierung oder Anreicherung häufig mit großem Aufwand verbunden ist, musste die Sensitivität des nichtradioaktiven Footprintings weiter verbessert werden. Dazu wurden Experimente durchgeführt, in denen die lineare Amplifikation der Nukleinsäurefragmente mehrmals - vergleichbar der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) - wiederholt wurde. Die Versuche mit DNA-Polymerasen mit proofreading-Aktivität (Vent, Pfu, Pwo) schlugen fehl, da es offenbar zu einer Verkürzung der Amplifikationsprodukte kam; dieses ließ sich auch durch Zugabe von Thiodesoxynukleotiden nicht verhindern. Eine Polymerase ohne proofreading-Aktivität (Taq) zeigte weniger zusätzliche Banden, dafür an das 3´-Ende der Nukleinsäuren zusätzlich angehängte Nukleotide. Mit einem Derivat der Taq-Polymerase, dem Stoffel-Fragment, blieb das Problem der zusätzlich angehängten Nukleotide erhalten, jedoch erfolgte keine Schädigung der Nukleinsäurefragmente. Zusätzliche Banden traten nicht auf, so dass sich das Stoffel-Fragment mit einem Amplifikationsfaktor von ungefähr 10 als beste Polymerase herausstellte.
Da die ausgearbeitete Methode in einen kommerziellen Kit umgesetzt werden sollte, musste die Übertragbarkeit des Protokolls auf andere DNA-bindende Proteine nachgewiesen werden und zugleich eine geeignete Positivkontrolle für das Kit gefunden werden. Erfolgreiche Footprint-Experimente mit dem Transkriptionsfaktor NF-KB zeigten, dass die Methode auch auf andere Protein-DNA-Interaktionen übertragbar ist. Als Positivkontrolle für den Kit stellte sich aber der Tet-Repressor heraus.
Sowohl das nichtradioaktive Footprinting mit DNase I als auch dasjenige mit DMS wurden in zwei unabhängigen Kits bis zur Marktreife entwickelt und eine entsprechende Bedienungsanleitung (Manual) angefertigt. Zur Markteinführung wurden Informationen an Distributoren weitergegeben und eine Patentierung angestrebt.


Fazit

Der aus gesundheitlichen und finanziellen Gründen anhaltende Trend, radioaktive Nachweisverfahren in der Molekularbiologie weitestgehend durch Alternativen zu ersetzen, wurde in diesem Projekt erfolgreich auf das Footprinting, den Nachweis von DNA-Protein-Wechselwirkungen, übertragen. Während bei der methodischen Entwicklung neue innovative Arbeit geleistet werden musste, erfolgte der Nachweis der jeweiligen DNA-Protein-Interaktion mit Hilfe eines in vielen Laboren bereits vorhandenen Sequenziergeräts. Diese Tatsache macht das neue nichtradioaktive Verfahren attraktiv für den Einsatz im Labor, da neben den Kosten für die im Rahmen des Projekts entwickelten Kits, keine zusätzlichen Investitionskosten anfallen. Dagegen unterscheiden sich radioaktives und nichtradioaktives Verfahren immer noch in ihrer Sensitivität. Welches Verfahren letztendlich angewendet wird, hängt von der jeweiligen Fragestellung und Verfügbarkeit der DNA und des Bindeproteins ab.