Promotionsstipendium: Dr. Mario Winkelmann

Anwendung kalorimetrischer Methoden zur Untersuchung des Alkanabbaus durch den Mikroorganismus Rhodococcus opacus 1CP

UmweltvertrĂ€gliche Biotenside aus RhodococcenMotivation:Mineralölkohlenwasserstoffe (MKWs), polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAKs), polychlorierte Biphenyle (PCBs) und Biarylether gehören zu den bedeutendsten organischen Umweltschadstoffen. Ein wesentlicher Faktor des schĂ€digenden Potentials dieser Verbindungen ist ihre Persistenz, welche unter anderem durch ihre außerordentlich schlechten Wasserlöslichkeit begrĂŒndet ist. Die damit verbundene schlechte BioverfĂŒgbarkeit erschwert den Abbau dieser organischen Schadstoffe durch Bodenmikroorganismen. Um sich diese Verbindungen trotzdem als Kohlenstoffquelle nutzbar zu machen, verfĂŒgen manche Mikroorganismen ĂŒber Strategien zur Verbesserung der BioverfĂŒgbarkeit. Eine solche Strategie ist die Produktion von amphiphilen, ober- und grenzflĂ€chenaktiven Verbindungen. Durch die Freisetzung dieser Biotenside sind Bakterien in der Lage die GrenzflĂ€chenspannung zwischen den organischen Verbindungen und dem umgebenden Wasser herabzusetzen und so unter anderem die Emulsionsbildung zu begĂŒnstigen. Bleiben die BiotensidmolekĂŒle an die Bakterienzellwand assoziiert, so bietet sich fĂŒr die Bakterien die Möglichkeit der Anlagerung an die hydrophoben Schadstoffe. Die verbreitetste Gruppe von Biotensiden sind die Glycolipide. Sie bestehen aus Zucker- und FettsĂ€urebausteinen. Verglichen mit synthetischen Tensiden, verfĂŒgen die Biotenside ĂŒber sehr gute tensidspezifische Kenndaten, wie z. B. eine in der Regel niedrigere kritische Micellbildungskonzentration (cmc). DarĂŒber hinaus sind sie schnell biologisch abbaubar und weit weniger toxisch als die synthetischen Tenside. Diese Eigenschaften favorisieren Biotenside fĂŒr den Einsatz sowohl bei umwelttechnologisch relevanten Prozessen, wie der Altlastensanierung oder ÖlschadensbekĂ€mpfung, als auch bei der Lebensmittelveredlung oder in den anspruchsvollen high-cost Anwendungen der Pharmazie und der Kosmetik. Einem großtechnischen Einsatz der Biotenside stehen allerdings noch die hohen Produktionskosten im Weg, welche unter anderem in teuren Aufreinigungsprozessen begrĂŒndet liegen. Zur Verbesserung der bislang nicht gegebenen WettbewerbsfĂ€higkeit der Biotenside ist eine Vertiefung der Kenntnisse ĂŒber die molekularen Grundlagen der Biotensidsynthese erforderlich. Ein besseres VerstĂ€ndnis der Biosynthese bildet wiederum die Grundlage fĂŒr die Konstruktion leistungsfĂ€higer ProduktionsstĂ€mme. Diese Kenntnisse fehlen bisher weitgehend fĂŒr Trehaloselipide, eine Gruppe neutraler und anionischer Glycolipide, welche von Rhodococcen und anderen Vertretern der Actinomyceten vornehmlich bei Wachstum auf Alkanen gebildet werden. Nichtionische Trehaloselipide zeigen ein hervorragendes Emulgationsverhalten fĂŒr Kohlenwasserstoffe und wurden in der Vergangenheit bereits erfolgreich in Pilotstudien zur ÖlschadensbekĂ€mpfung und ?Microbial Enanced Oil Recovery? eingesetzt.Problemstellung:Der Nachweis einer Beteiligung von Genen der Trehalose-6-phosphat-Synthase (otsA) und der Enoyl-Acylcarrierprotein-Reduktase (inhA) an der Trehalosedicorynomycolatsynthese soll durch Detektion auf Protein- und mRNA-Ebene zu definierten Zeiten des Wachstums bzw. der Biotensidbildung von Rhodococcus opacus 1CP gefĂŒhrt werden. Es ergibt sich dabei die Notwendigkeit der Aufzeichnung des Wachstumsverhaltens von Stamm 1CP wĂ€hrend der Biotensidbildung. Dies ist im Gegensatz zum Wachstum auf löslichen Substraten nicht durch klassische TrĂŒbungsmessungen möglich. WĂ€hrend der Kultivierung von Rhodococcus opacus 1CP auf langkettigen Alkanen kommt es aufgrund der Wasserunlöslichkeit der Substrate zur Aggregation von Zellen und zur Entstehung von Substrat/Öl-Partikeln. Diese InhomogenitĂ€ten verhindern eine photometrische Kontrolle des Wachstumsverlaufes ebenso wie eine reproduzierbare Probennahme zur Biomassebestimmung.Lösungsansatz:Statt der photometrischen Kontrolle des Wachstumsverlaufes sollen im Rahmen des Projekts kalorimetrische Methoden zur Bestimmung des Wachstumszustandes eingesetzt werden. Die Kalorimetrie erlaubt im Gegensatz zu den photometrischen Methoden prinzipiell uneingeschrĂ€nkt die Aufzeichnung des Metabolismus unterschiedlichster Zellkulturen. Die WĂ€rmeleistung ist dabei proportional zum physiologischen Zustand der Kultur. Weitere Vorteile der Kalorimetrie sind der nicht-invasive Charakter der Methode sowie die zeitnahe, kontinuierliche Messwerterfassung.Mit Hilfe kalorimetrischer Methoden soll das Wachstumsverhalten von Rhodococcus opacus 1CP auf n-Alkanen reproduzierbar verfolgt werden. Nachfolgende regulatorische Untersuchungen sollen Hinweise auf die Auswirkung unterschiedlicher Kultivierungsparameter auf die Biotensidausbeute liefern. Dies ermöglicht eine Optimierung der Kulturbedingungen hin zu einer möglichst hohen Trehaloselipidausbeute. Zur Festlegung eines gĂŒnstigen Erntezeitpunktes werden kalorimetrisch ĂŒberwachte AnsĂ€tze zu definierten Zeitpunkten abgebrochen und hinsichtlich ihres Biomasse/ Biotensid-VerhĂ€ltnisses bestimmt.FĂŒr den Nachweis der Beteiligung von Trehalose-6-phosphat-Synthase OtsA und Enoyl-ACP-Reduktase InhA an der Biotensidbildung erfolgt die Untersuchung der erhaltenen Biomasse zu verschiedenen Zeitpunkten des Wachstums auf Protein- und mRNA-Ebene hinsichtlich der Expression beider Enzyme. Zum Einsatz kommen hierzu klassische Methoden der 2D-PAGE bzw. der rTPCR und der RNA/DNA- Hybridisierung.

AZ: 20002/296

Zeitraum

01.07.2002 - 30.06.2005

Institut

Technische UniversitÀt Bergakademie Freiberg
Institut fĂŒr Physikalische Chemie

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Betreuer

Prof. Dr. G. Wolf