Promotionsstipendium: Dr. Michael Cornelius

Analyse von DNA- und RNA-Modifikationen durch Fluoreszenz-Postlabeling mit BODIPY und Kapillarelektrophorese mit Laser-induzierter Fluoreszenzdetektion

DNA-Addult-Analytik mit CE-LIF in vivoViele der bekannten krebserzeugenden Substanzen bzw. deren Metabolite binden kovalent an die DNA unter Bildung von DNA-Addukten. Diese DNA-Addukte sind spezifisch fĂŒr die jeweilige genotoxische Substanz und stellen daher individuelle innere Dosimeter der Exposition dar. Da sie molekulare Bestandteile des Krebsprozesses sind, werden sie als Biomarker des Krebsrisikos in epidemiologischen Studien eingesetzt. Um die Bedeutung der DNA-Addukte bei Krankheiten wie Krebs zu ermitteln, ist es notwendig, empfindliche Analysenmethoden zu entwickeln, die einen hohen Durchsatz von biologischen Proben sowie eine simultane Detektion verschiedener DNA-Adduktklassen gewĂ€hrleisten.Die zur Zeit empfindlichste Methode ist das 32P-postlabeling, mit der die Detektion von 1 Addukt in 1 Milliarde normalen Nukleotiden gelingt, was die Untersuchung von humanen Proben ermöglicht. Allerdings weist auch diese Methode Nachteile auf (schlechte Reproduzierbarkeit, keine Automatisierungsmöglichkeit, Belastung durch RadioaktivitĂ€t). Daher wurde in der Gruppe von Prof. Wießler eine neue analytische Methode entwickelt, die auf einer Fluoreszenzderivatisierung von Mononukleotiden bzw. DNA-Addukten beruht und die Kapillarelektrophorese mit Laser-induzierter Fluoreszenz zur Trennung bzw. Detektion verwendet (CE-LIF). Mit dieser neuen Methode gelang die gleichzeitige Bestimmung einiger endogen- und exogen-gebildeter DNA-Addukte aus in vitro Proben. Allerdings liegt die Nachweisgrenze bei 1 Addukt in 1 Million normalen Nukleotiden, was fĂŒr in vivo Analysen nicht ausreicht. Daher ist es mein Ziel, die Empfindlichkeit der CE-LIF Methode so zu verbessern, daß in vivo Bestimmungen, insbesondere aus Blutproben, möglich werden. Hierzu werden DNA-Addukt-Anreicherungs-Verfahren und die Verbesserung der Fluoreszenzderivatisierung erprobt. Diese Anreicherungsverfahren sollen zur Bestimmung der DNA-Addukte des Umweltschadstoffes 3-Nitrobenzanthron (3-NBA) im Blut und in Organen der Ratte angewendet und vergleichend mit dem 32P-Postlabeling Verfahren untersucht werden. Zur Optimierung der Anreicherungsbedingungen werden synthetisierte 3-NBA-DNA-Addukt Standardverbindungen eingesetzt. Die Erhöhung der Empfindlichkeit der CE-LIF Methode ermöglicht den Nachweis von exogenen DNA-Addukten in vivo, was die Anwendung als Biomonitor- Methode beim Menschen erlaubt.

AZ: 20002/264

Zeitraum

01.06.2002 - 31.05.2005

Institut

Ruprecht-Karls-UniversitÀt Heidelberg
DKFZ Heidelberg
Molekulare Toxikologie

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Betreuer

Prof. Dr. Manfred Wiessler