Projekt 11163/01

Entwicklung und Optimierung eines praxistauglichen Verfahrens zum selektiven Nachweis vitaler Cryptosporidien-Oozysten und zum Nachweis von Giardien-Zysten in Wasserproben mit Hilfe der PCR und Multiplex-PCR

ProjekttrÀger

Eberhard-Karls-UniversitĂ€t TĂŒbingenHygiene InstitutAbteilung fĂŒr Allgemeine Hygiene und Umwelthygiene
Wilhelmstr. 31
72074 TĂŒbingenZielsetzung und Anlass des Vorhabens Cryptosporidien und Giardien sind humanpathogene Parasiten, die ĂŒber menschliche und tierische FĂ€kalien incl. KlĂ€ranlagenablĂ€ufe in die Umwelt gelangen. Insbesondere in GewĂ€ssern, die zur Trinkwassergewinnung oder als BadegewĂ€sser dienen, können sie als belebte Schadstoffe fĂŒr die menschliche Gesundheit betrachtet werden. Der Nachweis der Parasiten im Wasser ist schwierig und wird z. Zt. routinemĂ€ĂŸig mit dem Mikroskop durchgefĂŒhrt. Diese Methode ist zeitaufwendig, von subjektiven Kriterien abhĂ€ngig und kann zu Fehldiagnosen fĂŒhren. Ziel des Vorhabens ist es, bereits vorhandene und z. T. patentierte Nachweisverfahren auf der Basis molekularbiologischer Methoden durch Kombination mit anderen Techniken anwendungsreif zu machen. Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenIn der ersten Phase des Projekts werden die bereits etablierten Verfahren a) Verdau freier DNA + In-vitro-Exzystierung + DNA-Extraktion + PCR fĂŒr Cryptosporidien (kurz IVE-PCR) und b) das Verfahren der Multiplex-PCR fĂŒr Cryptosporidien und Giardien optimiert. Der Kooperationspartner 4base Lab konstruiert fĂŒr geeignete Primerpaare interne Kontrollen. Das TaqMan PCR Verfahren wird etabliert und seine Eignung fĂŒr die genannten Methoden evaluiert. Die PCR-Verfahren werden anschließend mit den bereits bekannten Anreicherungstechniken IMS (Immunomagnetische Separation, Kooperationspartner DYNAL) und FACS (Fluorescence Activated Cell Sor-ting, Kooperationspartner Strathclyde Water Services) kombiniert. Die EffektivitĂ€t und Reproduzierbarkeit der Verfahren wird in einer zweiten Phase im Rahmen von Ringversuchen mit den Kooperationspartnern (SPDL, Strathclyde WS, 4base Lab) getestet. Die PCR-Produkte verschiedener Cryptosporidien-Isolate werden bei 4base Lab sequenziert, um festzustellen, ob die VariabilitĂ€t innerhalb der PCR-Zielsequenz (Template) so groß ist, daß eine Unterscheidung von verschiedenen StĂ€mmen möglich wird. Dies wĂ€re fĂŒr epidemiologische Fragestellungen (Zusammenhang zwischen Umweltisolaten und Patientenisolaten) von goßem praktischem Nutzen und wĂŒrde einen weiteren entscheidenden Vorteil der genannten molekularbiologischen Nachweismethoden darstellen. In einer dritten Projektphase werden die entwickelten Methoden in Feldversuchen eingestetzt. Bei nachgewiesener Eignung der Verfahren erfolgt eine Publikation der Methoden sowie ggf. eine Lizenzvermarktung fĂŒr die patentierten Teile Ergebnisse und Diskussion Durch Vergleich von 9 verschiedenen Cryptosporidien-Primerpaaren, 5 verschiedenen Giardienprimerpaaren und 4 verschiedenen Kombinationen fĂŒr die Multiplex-PCR konnten die jeweils optimalen Primer mit einer SensitivitĂ€t von 1-10 Oozysten bzw. Zysten ermittelt werden. FĂŒr den Cryptosporidien-Nachweis wurde ein TaqMan-PCR-Protokoll mit Interner Kontrolle entwickelt. FĂŒr die Interne Kontrolle wurde die Bindungsstelle der TaqMan-Sonde entfernt und durch ein um 40 Basen lĂ€ngeres Insert aus dem humanen Insulingen ersetzt. Um die Interne Kontrolle vom Original unterscheiden zu können, wurde eine zweite TaqMan-Sonde konstruiert, die nur an das Insert binden kann. Durch die unterschiedliche LĂ€nge von Original und Interner Kontrolle können beide PCR-Produkte aber auch auf einem konventionellen Agarosegel gut unterschieden werden. ZusĂ€tzlich wurden die PCR-Protokolle fĂŒr den Giardien-Nachweis und den Cryptosporidien-Nachweis an eine Anwendung im LightCyclerℱ adaptiert. Die Light-Cycler-PCR ist die derzeit modernste Form der PCR, bei der ein Ă€hnliches Nachweisprinzip wie bei der TaqMan-PCR zum Tragen kommt, gleichzeitig aber die Analysenzeit durch eine Amplifikation in Glaska-pillaren drastisch verkĂŒrzt wird. Auch die in vitro Exzystierung wurde fĂŒr den anschließenden PCR-Nachweis methodisch optimiert. Die im Hinblick auf eine Multiplex-PCR getesteten Primer-Paare hatten fĂŒr sich genommen zwar eine zufriedenstellende SensitivitĂ€t, bei ungleichem MengenverhĂ€ltnis von Cryptosporidien und Giardien im Probenmaterial traten jedoch Interferenzen zwischen den beiden Einzelreaktionen auf, die zur UnterdrĂŒckung einer der beiden Reaktionen fĂŒhrten. Die Methode des Fluorescence Activated Cell Sorting zur Isolierung der Zielorganismen war ebenfalls unbefriedigend, da sie im Gegensatz zur Immunomagnetischen Separation in der Praxis keine Alternative zur Saccharoseflota-tion darstellte. Feldversuche und Ringversuche wurden daher ausschließlich mit separaten PCR-Methoden und in Kombination mit der IMS durchgefĂŒhrt. Die Feldversuche an verschiedenen OberflĂ€-chenwĂ€ssern, KlĂ€ranlagenablĂ€ufen und TrinkwĂ€ssern ergaben eine zufriedenstellende Übereinstimmung zwischen den PCR-Resultaten und den mikroskopisch ermittelten Vergleichswerten. Probleme ergaben sich z. T. bei der quantitativen PCR mit falsch positiven oder zu hohen Resultaten. An den Ringversuchen beteiligten sich das Hygiene-Institut TĂŒbingen, 4 base lab und das SPDL. Die bei Strathclyde Wa-ter Services geplanten FACS-Analysen wurden aus den o. g. GrĂŒnden nicht durchgefĂŒhrt. Statt dessen wurde die Analysenzahl mit IMS verdoppelt. Das Ringversuchsprotokoll wurde in Anlehnung an Ringver-suchsvorschriften gestaltet, die vom britischen Drinking Water Inspectorate Mitte 1999 herausgegeben wurden. Demzufolge wurde als Probenmatrix jeweils 100 Liter hartes und weiches Trinkwasser verwen-det. Jedes der drei Laboratorien hatte insgesamt 72 Einzelanalysen durchzufĂŒhren: 36 aus hartem Wasser und 36 aus weichem Wasser. Jeweils 12 mit IMS gereinigte Proben wurden mikroskopisch, sowie mit konventioneller nested-PCR (hartes Wasser nur in 2 Laboratorien) und mit quantitativer LightCycler-PCR untersucht. Es wurden Konzentrationen von 0, 10 und 100 Oozysten pro Ansatz eingesetzt. Dabei stellte sich eindeutig heraus, dass die IMS in weichem Wasser besser funktionierte als in hartem Wasser. Auf die PCR-Ergebnisse hatte die WasserhĂ€rte jedoch keinen offensichtlichen Einfluss. Bei der qualitativen nested PCR ergab sich lediglich ein falsch positives und ein eindeutig falsch negatives Ergebnis. Weitere 7 negative Resultate ergaben sich bei Konzentrationen, die mikroskopisch ebenfalls negativ wa-ren oder sehr niedrige Oozystenzahlen enthielten (1, 2, 2 bzw. 10 Oozysten). Die LightCycler-Ergebnisse waren fĂŒr eine quantitative PCR in diesen niedrigen Konzentrationsbereichen erstaunlich prĂ€zise. Auch hier gab es jedoch vereinzelt falsch positive und falsch negative Resultate. Bei 100 eingesetzten Oozysten pro 100 Liter trat jedoch nur ein einziges falsch negatives Resultat auf. Die Versuche zur Sequenzierung von PCR-Produkten ergaben, dass sowohl bei Cryptosporidien als auch bei Giardien Sequenzunterschiede auftreten, die eine Unterscheidung von mindestens zwei bis drei Genotypen zulĂ€sst. Öffentlichkeitsarbeit und PrĂ€sentation Status-Kolloquium in TĂŒbingen; VortrĂ€ge: OECD Interlaken, DGHM Berlin, DGHM Regensburg, DGP Hohenheim; Poster: DGHM Regensburg, DGHM MĂŒnchen, IAW 2000 Paris; Zeitschriften-Beitrag: Re-view in J. Indust. Microbiol. Biotechnol.; Buchbeitrag: in Rapid Cycle Real Time PCR - Methods and Applications, Springer Verlag; Internet: Kurzfassung der VortrĂ€ge des Statuskolloquiums (Online Publikations-Server der Uni TĂŒbingen), DBU-Zwischenbericht (Homepage des Hygiene-Instituts), Beitrag zu Molecular Technologies for Safe Drinking Water (Homepage der EAWAG, Schweiz). Fazit Als alternative Methode zum mikroskopischen Nachweis erscheint die LightCycler-PCR in Kombination mit der IMS in verschiedener Hinsicht am geeignetsten: kurze Analysezeit, quantitatives Ergebnis, gerin-ge Kontaminationsgefahr bei ausschließlicher Anwendung. Diese Methode bleibt daher am Hygiene-Institut dauerhaft etabliert und wird auch bei 4 base lab weiterhin angeboten. Es bestehen hier auch weitere Optimierungsmöglichkeiten: z. B. durch die Konstruktion von exakt definierten und lange haltba-ren synthetischen Standards, die die Referenz-Oozsten ersetzten können, die derzeit noch im Tier produziert werden mĂŒssen und derzeit sowohl fĂŒr die mikroskopische als auch fĂŒr die PCR-Methode not-wendig sind.

Übersicht

Telefon

07071/29-82073

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Bundesland

Baden-WĂŒrttemberg

Fördersumme

143.163,77 €

Förderzeitraum

28.08.1997 - 31.10.2000