Projekt 08535/01

Entwicklung eines neuen Verfahrens zur Wachstumsförderung und biologischen Bekämpfung bodenbürtiger Pathogene mit natürlich vorkommenden nützlichen Rhizobakterien

Projektträger

Bayer CropScience Biologics GmbH
Inselstr. 12
23999 Malchow
Telefon: 038425/23-0

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Exemplarische Entwicklung eines biologischen Pflanzenschutzmittels auf der Basis eines gut charakterisierten Bakterienstammes mit dem Anspruch auf kommerzielle Nutzung. Im Mittelpunkt steht die Erarbeitung optimaler Fermentationsparameter zur Konditionierung Gram-negativer, nicht sporenbildender Bakterien für einen anschließenden Formulierungsprozess. Mittels Testsystemen unter Einbeziehung bodenbürtiger Schadpathogene (Verticillium spp., Rhizoctonia spp.) im Winterrapsanbau sollen die Effektivität der erarbeiteten Formulierungsvarianten untersucht werden. Am Ende der Entwicklung soll ein marktfähiges biologisches Präparat zur Verfügung stehen, welches zur Substitution fungizider Bodenbehandlungen mit synthetischen Präparaten beitragen soll.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDurch eine Optimierung von Fermentationsmedien und Fermentationsparametern soll ein Verfahren zur Massenvermehrung von Pseudomonas fluorescens bzw. Serratia plymuthica erarbeitet werden. Die Realisierung hoher Zelldichten mit konstant hohen antifungischen Eigenschaften sowie mit einer hohen Exudation extrazellulärer Polysaccharide bilden dabei die maßgeblichen Ziele. Durch ein Scale-up-Prozess soll das optimale Fermentationsverfahren ohne Qualitätsverlust beim Fermentationsprodukt in den
Produktionsmaßstab überführt werden. Die Eignung verschiedener Separationsverfahren zur schonenden Gewinnung der Zellen soll dabei untersucht werden. Parallel dazu sollen die Entwicklung eines geeigneten Formulierungsverfahrens mittels Wirbelschicht-, Sprüh- oder Gefriertrocknung sowie die Untersuchungen zur Wirkung der formulierten und nicht formulierten Bakterien durchgeführt werden. Durch Variation von Prozessparametern und Einsatz osmotisch wirksamer Hilfsstoffe soll eine schonende, vitalitätserhaltende Trocknung der Bakterienzellen realisiert werden. Neben der antifungischen Wirksicherheit sollen Lagerstabilität und Anwenderfreundlichkeit des Präparates als Zielparameter dienen.


Ergebnisse und Diskussion

In dem Forschungsprojekt (Az 08535) wurden Methoden zur Produktion und Formulierung von gramnegativen Bakterien der Arten Serratia marcescens, Pseudomonas chlororaphis sowie der grampositiven Arten Streptomyces albidoflavus und S. rimosus entwickelt.
Die selektierten Bakterien wurden mit phänotypischen (API, BIOLOG, Antibiogramm, Fettsäureanalyse) und genotypischen Methoden charakterisiert, um sie auf Grund spezifischer Eigenschaften oder spezifischer molekularer Fingerprints von anderen Isolaten der gleichen Art unterscheiden zu können. Die hierzu verwendeten Methoden des DNA-Fingerprintings ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restrictions Analysis), Box-PCR (Polymerase Chain Reaction) und PFGE (Pulsed Field Gel Elektrophoresis) führten zur genauen Charakterisierung der oben genannten Arten. Hierdurch werden einerseits die patentrechtli-che Überwachung der Nutzung dieser Bakterien andererseits aber auch ökologische Beobachtungen (z.B. Populationsdynamik) unter unsterilen Bedingungen (Boden, Rhizosphäre) ermöglicht.
Im zweiten Arbeitsschritt wurde unter Nutzung einer Pilotanlage für die genannten Bakterien ein opti-miertes Fermentations- und Formulierungsverfahren entwickelt. Dabei wurde besonders die Fähigkeit der gramnegativen Bakterien zur Produktion extrazellulärer Polysaccharide sowie der grampositiven Bakterien zur Bildung von Endosporen genutzt. Diese Eigenschaften verbessern die Überlebensrate der Bakterienzellen im Formulierungsprozess und während der Lagerung als formuliertes Produkt und ermöglichen dadurch erst die Handhabung als biologisches Pflanzenschutzmittel. Unter Nutzung dieser Produktionsverfahren war es möglich, Präparate herzustellen, welche für einen Versuchszeitraum von drei Monaten relativ stabile Eigenschaften aufwiesen. Auf Grundlage der vorliegenden Ergebnisse erscheint die Herstellung entsprechender praxisgerechter Präparate auf kommerziellem Niveau ohne wesentliche Modifikationen möglich. Weitere Untersuchungen sollten die im Forschungsprojekt erzielten Ansätze nutzen und sich insbesondere der Induktion bakterieller Exopolysaccharid-Produktion im Fermentationsprozess widmen. Die Autoren sehen darin eine herausragende Möglichkeit, nicht Sporen bildende Bakterien im Sinne einer verbesserten Haltbarkeit in nachfolgenden Formulierungsprozessen zu konditionieren. Dadurch würden bisher nicht vorhandene Möglichkeiten für die Verwendung hoch potenter gram-negativer Bakterien als biologische Pflanzenschutzmittel ergeben.
Die Wirksamkeit der entwickelten Bakterienformulierungen wurde am Pathosystem Rhizoctonia solani - Zuckerrübe, Salat bzw. Kartoffel untersucht. Grundsätzlich konnte festgestellt werden, dass die formulierten Bakterien eine verbesserte Wirksamkeit im Vergleich zu nicht formulierten Fermenterbrühen aufwiesen. Die Wirkung der Bakterienformulierungen zur Bekämpfung von R. solani an Zuckerrüben konnten insgesamt nicht befriedigen. Der Behandlungseffekt beschränkte sich auf eine Förderung des Pflanzenwachstums. Befallsreduktionen waren in den meisten Fällen nicht signifikant. Weil es sich in den Praxisversuchen meist um Tastversuche handelte, waren die Anwendungsstrategien für die entsprechenden Präparate noch wenig entwickelt, so dass durch weiteren Erfahrungszuwachs in diesem Bereicht verbesserte Wirkungsgrade erzielt werden können. An Salat konnten insbesondere Formulierungen von Serratia marcescens C51 und Pseudomonas chlororaphis L29-1-8 eine gute Bekämpfung von R. solani gewährleisten. Kombiniert mit den zusätzlichen wachstumsstimulierenden Effekten dieser Bakterienformulierungen an Salat erscheint eine Überführung als Pilotprodukt in die praktische Anwendung als sehr aussichtsreich. Gleiches lässt sich für die Anwendung dieser Bakterien als Pflanzenstärkungsmittel für die Anwendung in Erdbeerkulturen feststellen. In weiteren Versuche soll eine Optimierung der Produktformulierung und der Einsatzstrategie erreicht werden.
Die kommerzielle Nutzung des im Projekt erarbeiteten Know-hows wird in erster Linie abhängig sein von der Größe des potentiellen Marktes und von der Wirksamkeit des entwickelten Pflanzenschutzmittels. Gleichzeitig muss ein Pflanzenschutzpräparat gemäß den geltenden Richtlinien in einem Zulassungsverfahren für die Anwendung im Pflanzenbau geprüft werden. Es ist geplant, in weiteren Praxisversuchen die Wirksamkeit insbesondere des Bakterium S. marcescens C51 weiter zu optimieren und eine Grundlage zu schaffen, welche den Aufwand einer Zulassung und mittelfristige Markteinführung eines neuen Produktes rechtfertigen.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Publikationen
Berg, G., and P. Lüth. 1999. Das Rhizobakterienisolat Streptomyces rimosus HRO71 zur Pflanzenstärkung und Anwendung gegen phytopathogene Bodenpilze an verschiedenen Kulturpflanzen. Deutsches Patent 199-28-690.6.
Marten, P., Minkwitz, A., Brückner, S., Lüth, P. and G. Berg. 2000. Biologische Kontrolle pflanzenpathogener Pilze mit Rhizovit auf der Basis von Streptomyces spec. DSMZ 12424. Mitt. Biol. Bundesanstalt 376:573-574.
Marten, P., Brückner, S., Minkwitz, A., Lüth, P. and G. Berg. 2000. Rhizovit®: Impact and formulation of a new bacterial product. In: Formulation of microbial inoculants. COST Action 830/Microbial inoculants for agriculture and environment. Koch, E. and P. Leinonen (eds.). 78-82.
Berg, G., Marten, P., Minkwitz, A., and S. Brückner. 2001. Efficient Biological Control of fungal plant diseases by Streptomyces rimosus DSMZ 12424. J. Plant Dis. Protect. 108:1-10.
Berg, G., Marten, P., Minkwitz, A., Brückner, S., and P. Lüth. 2001. Efficient Biological control of fun-gal plant diseases by Streptomyces sp. DSMZ12424. IOBC Bulletin 24:9-14.
Marten, P., Brückner, S., and G. Berg. 2001. Biologischer Pflanzenschutz mit Rhizobakterien - eine umweltfreundliche Alternative zur Kontrolle boden- und samenbürtiger Pilze. Gesunde Pflanzen 53:224-234.
Vorträge
Januar 1999: Vortrag am Institut für Mikrobiologie der Universität Tübingen (Prof. Dr. G. Winkelmann) Antagonistische Rhizobakterien: Interaktionen und Biologischer Pflanzenschutz
April 1999: Biological control of Verticillium wilt in strawberry and oilseed rape. X. Conference: Methods of estimation of biological control agents in the protection of plants against soil-borne pathogens. Skier-newice/Polen.
Januar 2000: Vortrag am Institut für Botanik der Universität Hamburg (Prof. Dr. Adam) Rhizobakterien im Biologischen Pflanzenschutz
Juni 2000: Vortrag am Institut für Kulturpflanzenforschung (Dr. Hofemeister) in Gatersleben Antagonisti-sche Rhizobakterien: Analyse und Anwendung im Pflanzenschutz Januar 2001: Vortrag an der Biologi-schen Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft (Dr. Kornelia Smalla) in Braunschweig Strategie zur Bewertung potentieller Biological Control Agents von Verticillium-Wirtspflanzen
Juli 2001: Vortrag am Institut für Zierpflanzenforschung (Dr. D. Schwarz) in Großbeeren: Antagonistische Rhizobakterien im biologischen Pflanzenschutz: Potenzial und Risiken
November 2001: Vortrag an der Universität Kiel (Dr. U. Ehlers): Antagonistische Bakterien: Analyse und Potenzial für den biologischen Pflanzenschutz
Poster
Brückner, S.; Berg, G.; Marten, P.; Minkwitz, A.; Metz, G. 1999. Biologische Kontrolle von samenbürti-gen Pilzpathogenen an Gemüse- und Gewürzpflanzen durch Beizung des Saatgutes mit nützlichen Bakterien. 2. Symposium Phytomedizin und Pflanzenschutz im Gartenbau, Wien, Austria, 1999.
Marten, P., Minkwitz, A., Brückner, S., Lüth, P. and G. Berg. 1999. Rhizovit: impact and formulation of a new bacterial product. EU-Workshop Formulation of microbial inoculants 5.-6-2.1999 in Braunschweig.
Marten, P., Minkwitz, A., Brückner, S., Lüth, P. and G. Berg. 1999. Rhizovit: impact and formulation of a new bacterial product. X. Conference Methods of estimation of biological control agents in the protection of plants against soil-borne and leaf pathogens. 22.-23.4.1999 in Skierniewice (Poland).
Berg, G., Marten, P., Minkwitz, A., Brückner, S., and Lüth, P. 1999. Biological control of soil-borne diseases with Rhizovit based on Streptomyces rimosus. Internat. Symposium Biological control agents in crop and animal protection. 24.-28.8.1999 in Swansea (UK).
Berg, G., Marten, P., Minkwitz, A., Brückner, S., and Lüth, P. 1999. Biological control of soil-borne diseases with Rhizovit based on Streptomyces rimosus. COST Workshop: Nematode-Rhizobacteria in-teraction. Bonn.
Marten, P., Minkwitz, A., Brückner, S., Lüth, P., and Berg, G. 2000. Biologische Kontrolle pflanzen-pathogener Pilze mit Rhizovit® auf der Basis von Streptomyces spec. DSMZ 12424. Pflanzenschutztagung Weihenstephan.
Berg, G., Marten, P., Minkwitz, A., and S. Brückner. 2000. Efficient biocontrol of fungal plant diseases by Rhizovit® on the basis of Streptomyces sp. DSMZ 12424. Intern. Workshop Biocontrol agents: modes of action and their interaction with other means of control. Sevilla/Spain.
Berg, G., Marten, P., Minkwitz, A., and S. Brückner. 2000. Biological control of fungal plant diseases: Rhizovit® on the basis of Streptomyces sp. DSMZ 12424. 9th International Symposium on Microbial Ecology Interactions in the Microbial World in Amsterdam.


Fazit

Die im Projekt erarbeiteten Ergebnisse zeigen, dass die Herstellung eines biologischen Pflanzenschutzmittels auf der Basis Endosporen bildender bzw. Exopolysaccharid bildender Bakterien möglich ist. Die entwickelten Pilotformulierungen von Streptomyces rimosus, Pseudomonas fluorescens und Serratia marcescens erfüllen bezüglich Handhabbarkeit prinzipiell die Erfordernisse eines kommerziell nutzbaren Präparates. Aufgrund komplexer Probleme bei der Durchführung von Wirksamkeitstest im Gewächshaus und in Feldversuchen konnten noch keine abschließenden Aussagen über Marktfähigkeit der entwickelten Präparate gemacht werden. Diese Fragestellung soll in nachfolgend durchgeführten Untersuchungen beantwortet werden. Es ist geplant, die Herstellung des Stammes S. marcescens als biologisches Pflanzenstärkungs- bzw. Pflanzenschutzmittel im kommerziellen Maßstab zu entwickeln und zu etablieren.