Projekt 07833/01

Entwicklung und Anwendung miniaturisierter automatisierter Testverfahren zur humantoxikologischen und ökotoxikologischen Bewertung von Schadstoffen in Umweltproben

ProjekttrÀger

Rheinisch-WestfĂ€lische Technische Hochschule(RWTH) AachenInstitut fĂŒr Hygiene und Umweltmedizin
Pauwelsstr. 30
52057 AachenZielsetzung und Anlass des Vorhabens Bereitstellung standardisierter automatisierter Testmethoden zur Bestimmung der ÖkotoxizitĂ€t, der MutagenitĂ€t und GenotoxizitĂ€t sowie der HumantoxizitĂ€t von Schadstoffen in Umweltproben. Bestehende Testverfahren sollen durch neue Verfahren ergĂ€nzt und erweitert sowie in miniaturisierte Form, d.h. in einen Mikrotiterplattenmaßstab, ĂŒberfĂŒhrt werden. Dies soll zukĂŒnftig eine kostengĂŒnstige Testung großer Probenzahlen ermöglichen. Die Testsysteme sollen von Endpunktmessungen auf kinetische Datenaufnahme durch kontinuierliche Messung umgestellt werden. Dies ermöglicht eine wesentliche Steigerung von AussagefĂ€higkeit, Testempfindlichkeit und -sicherheit. Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie Bestimmung der methodischen Grenzen und Möglichkeiten zur Miniaturisierung und Automatisierung ausgewĂ€hlter Biotestverfahren erfolgt durch direkten Vergleich mit bereits etablierten Makrotests. AusgewĂ€hlte Biotestsysteme sind z.B. Leuchtbakterientest mit Vibrio fischeri zur Bestimmung der akuten ToxizitĂ€t (DIN 38 412 Teil 34 bzw. 341), der Vibrio fischeri-Wachstumstest zur Bestimmung der chronischen ToxizitĂ€t (Zellvermehrungstest) (DIN-Enwurf, Stand MĂ€rz 1995), der Pseudomonas putida-Wachstumstest (Zellvermehrungstest) (DIN 38 412 Teil 8), Algentest (Scenedesmus-Zellvermehrungs-Hemmtest) (DIN 38412, Teil 33), SOS-Chromotest mit Escherichia coli (DIN-Entwurf) und der umu-Test mit Salmonella typhimurium (DIN 38 415 Teil 3). Die Etablierung eines Nitrifikations-Hemmtests ist geplant sowie der Einsatz anderer lumineszenter Bakterien (wie z.B. Photorhabdus luminescens oder Luxtransgener Bacillus sp. oder E. coli-StĂ€mme) als Ersatz fĂŒr den marinen V. fischeri. Die Messung der Dosis/Wirkungsbeziehungen erfolgt in Mikrotitrationsplatten mittels Automaten (Photometrie, Fluorometrie und Luminometrie). Neue lasernephelometrische Verfahren werden erprobt. Die Testung der Automaten erfolgt mit Prototypen der Firmen MERLIN Diagnostika GmbH und OPAL JENA GmbH gemĂ€ĂŸ dem jeweiligen Entwicklungsstand. Durch stĂ€ndigen Kontakt mit den Kooperationspartnern soll eine Optimierung der GerĂ€tetechnik erzielt werden. Die Validierung erfolgt anhand von Referenztoxen und nativ belasteten Bodenproben. Ergebnisse und Diskussion Teilprojekt A: Miniaturisierung und Automatisierung von ÖkotoxizitĂ€ts- und MutagenitĂ€tstests - Definition der methodischen und technischen Anforderungen Im vergangenen Bearbeitungsabschnitt wurden grundlegende Arbeiten zur Etablierung und Miniaturisierung der einzelnen Testverfahren durchgefĂŒhrt. Die Testanforderungen, -designs, -layouts und -probleme wurden definiert. Die Zellvermehrungs- hemmtests mit Vibrio fischeri, Pseudomonas putida und Photorhabdus luminescens sowie die Lumineszenzhemmtests mit V. fischeri und Ph. luminescens liegen in miniaturisierten Verfahren vor. Die Validierung der miniaturisierten Tests wurde begonnen und anhand vorrangiger Fragestellungen wie Probenvor- und -aufarbeitung, Eignung der Systeme fĂŒr bestimmte Probengruppen, Reproduzierbarkeit und Optimierung der AussagefĂ€higkeit der Testsysteme, gewichtet. Schwerpunkte bildete vor allem eine Modifikation der Auswertungsmöglichkeiten, um einer kinetischen Datenaufnahme gerecht werden zu können. Die Testung mit komplexen Umweltproben wurde systematisch neben der Testung von Referenz- und Einzelproben vorgenommen. Die Validierung mit unterschiedlichen Probenmaterialien und eine Zusammenstellung von Kenndaten (G und EC-Werten) dauert an. Teilprojekt B: Humantoxikologische Testmethoden - Biological Effect Monitoring Die Gewinnung und Charakterisierung von monoklonalen Antikörpern gegen CYP1A-Isoenzyme konnten weitgehend abgeschlossen werden. Von den verschiedenen zur VerfĂŒgung stehenden Antikörpern sind einige selektiv fĂŒr CYP1A1 und erkennen auch das orthologe humane Isoenzym. Andere Antikörper erscheinen fĂŒr eine Kollektivbestimmung von CYP1A1 + CYP1A2 geeignet. Die laufenden Arbeiten befassen sich mit dem Einsatz dieser Antikörper in einem optimierten ELISA-Test. Hinsichtlich der Anwendung und Validierung des Testsystems wurden im Tiermodell Induktionsversuche mit real kontaminierten und kĂŒnstlich beaufschlagten Böden (Referenztoxen) durchgefĂŒhrt. WĂ€hrend die VerfĂŒtterung von real kontaminierten Böden eine Induktion des CYP1A1-Spiegels bewirkte, fanden sich nach oraler Aufnahme von Kontrollböden, die mit reinen 4- bis 7-Ring-PAK beaufschlagt wurden, keine Effekte auf den lebermikrosomalen CYP1A1-Spiegel. Zur KlĂ€rung dieses PhĂ€nomens wurden verschiedene Arbeitshypothesen aufgestellt und entsprechende Versuche begonnen. Teilprojekt C: Automatenentwicklung fĂŒr die Bodenprobentestung Das in Zusammenarbeit mit der Firma STRATEC entworfene Konzept fĂŒr einen Vollautomaten mit integrierter SchĂŒttel-, Dispensier-, Washer- und Inkubationseinrichtung, photometrischer und luminometrischer Meßeinheit sowie externer Liquidhandlingstation basiert auf dem PlateRunner Entwicklungsprojekt, einem modularen Multitasking-System fĂŒr die vollautomatische Bearbeitung von Mikrotitrationsplatten-Assays. Das Konzept fĂŒr Mikroplattenbewegungen auf dem Automaten arbeitet nach dem Prinzip eines vollautomatischen Hochregallagers. Teilprojekt D: Konstruktion, Herstellung und Erprobung eines Laser-Nephelometers fĂŒr das Mikrotitrationsplattenformat Es wurde ein Konstruktionsentwurf der optomechanischen Nephelometerbaugruppe des Lasernephelometers erstellt, eine Schaltung fĂŒr die Regelung der Laserleistung sowie fĂŒr die Detektorelektronik entwickelt und die Anpassung an einen A/D-Wandler vorgenommen. Eine erste Nephelometerbaugruppe wurde aufgebaut und eine Konstruktion der AufrĂŒstung zu einem Mikrotitrationsplattennephelometer vorgenommen. Parallel dazu erfolgten EntwĂŒrfe fĂŒr eine neue, fĂŒr die Lasernephelometrie besonders geeignete Mikrotitrationsplatte. Öffentlichkeitsarbeit und PrĂ€sentation EHRLICHMANN, H.; EISENTRÄGER, A.; KÜPPERS, D.; DOTT, W. Genotoxikologische Bewertung von Böden mit bakteriellen Testsystemen: Vergleich von Bodenextrakten, wĂ€ĂŸrigen Eluaten und aufkonzentrierten wĂ€ĂŸrigen Eluaten. 5. Kongreß der Gesellschaft fĂŒr Hygiene und Umweltmedizin in Aachen; 6. - 8. MĂ€rz 1997 SCHMITZ, R.P.H., EISENTRÄGER, A., DOTT, W. Möglichkeiten und Problemfelder miniaturisierter und automatisierter Zellvermehrungshemmtests mit Prokaryonten. 5. Kongreß der Gesellschaft fĂŒr Hygiene und Umweltmedizin in Aachen; 6. - 8. MĂ€rz 1997 SCHMITZ, R.P.H., EISENTRÄGER, A., DOTT, W. Wachstumskinetiken unter Schwermetalleinfluß - stoffspezifische und coergistische Effekte in miniaturisierten aquatischen Biotestsystemen mit Prokaryonten. FrĂŒhjahrstagung der Vereinigung fĂŒr Allgemeine und Angewandte Mikrobiologie e.V. (VAAM) in Hamburg, 16. - 19. MĂ€rz 1997 SCHMITZ, R.P.H.; LINDVOGT, T.; EISENTRÄGER, A.; JACOBI, N., MÖLLER, M.; DOTT, W. Nutzungsbedingte VerĂ€nderung des toxischen Potentials von Schmierfluiden auf der Basis von synthetischen Estern. 5. Kongreß der Gesellschaft fĂŒr Hygiene und Umweltmedizin in Aachen; 6. - 8. MĂ€rz 1997 Fazit Die Arbeiten wurden gemĂ€ĂŸ der zeitlichen Vorgaben in allen Teilprojekten durchgefĂŒhrt, bzw. sind im einzelnen dem Zeitplan voraus.

Übersicht

Telefon

0241/8088-485

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Bundesland

Nordrhein-Westfalen

Fördersumme

970.196,80 €

Förderzeitraum

01.07.1996 - 25.10.2000