Projekt 03402/01

Automatisierung von Nachweisverfahren fĂŒr die Beurteilung des kanzerogenen Risikos durch Umweltbelastungen: Verbesserungen beim Nachweis gentoxischer Effekte von Umweltschadstoffen

ProjekttrÀger

Ludwig-Maximilians-UniversitĂ€t MĂŒnchenWalther-Straub-InstitutAbteilungToxikologie
Nussbaumstr. 26
80336 MĂŒnchenZielsetzung und Anlass des Vorhabens Die Beurteilung des kanzerogenen Risikos fĂŒr die Bevölkerung gewinnt immer grĂ¶ĂŸere Bedeutung. FĂŒr die Krebsentstehung relevante Stoffe, wie Nitrosamine, aromatische Amine und polycyclische Kohlenwasserstoffe stammen aus der Umwelt, daneben aber auch aus Pharmaka, Nahrungs- und Genußmitteln. Das krebserregende Potential von Substanzen wird im Tierversuch ermittelt. Die frĂŒhesten nachweisbaren VerĂ€nderungen nach Kanzerogenaufnahme sind die Bildung kovalenter Addukte an die DNA. Eines der sensitivsten Methoden zur Erfassung solcher Addukten stellt derzeit das 32P-Postlabeling dar. Die bisherigen Verfahren haben jedoch noch eine Reihe von MĂ€ngeln, die den Einsatz fĂŒr ein effektives Biomonitoring am Menschen stark einschrĂ€nken. Eine entscheidende Verbesserung der bisher beschriebenen analytischen Methoden zu erreichen, ist das Ziel dieses Forschungsvorhabens. Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie am hĂ€ufigsten verwendeten Analysenverfahren wurden von uns vergleichend untersucht, mit dem Ziel die jeweiligen SchwĂ€chen zu charakterisieren und zu wesentlichen Verbesserungen zu kommen. Hierzu wurde die DNA von Ratten und MĂ€usen gewonnen, die zuvor mit Kanzerogenen, z.B. 4-Aminobi-phenyl, o-Toluidin, Benzo[a]pyren, behandelt worden waren. FĂŒr die beiden erstgenannten Substanzen wurde das wichtigste DNA-Addukt synthetisiert um fĂŒr die Chromatographie Vergleichsstandards zu bekommen. Nach Isolierung der DNA und Verdau zu den Mononukleotiden wurden folgende Verfahren zur Analyse der Addukte (ca 1 Addukt in 106 bis 1010 normalen Nukleotiden !) angewendet: Verdau mit Nuklease P1; Extraktion mit Butanol; Labeln mit ATP-Unterschuß; Festphasenextraktion offline mit C18-und LMS-BondElut-SĂ€ulchen und PEI (Polyethyleneimin), oder online in der HPLC-Anlage mit C18-SĂ€ulen (VorsĂ€ulenschalttechnik); die Analyse erfolgte wahlweise auf PEI-DC-Platten oder durch HPLC auf verschiedenen SĂ€ulen, der Nachweis der radioaktiven Proben durch Phosphor-Image-Analyse (DC, HPLC-Blotting) oder online durch RadioaktivitĂ€tsmonitoring. Als völlig neues Verfahren wird das HPLC-Blotting entwickelt. Dabei wurde das HPLC-Fließmittel nach der SĂ€ule auf Filterpapier aufgetragen. Die aufgetragenen Bahnen des Filters wurden anschließend auf RadioaktivitĂ€t untersucht. Ergebnisse und Diskussion Es hat sich gezeigt, daß ein wichtiger Schritt in den meisten publizierten Analysenprotokollen, die Anreicherung der Nukleotid-Addukte, mit großen Verlusten verbunden ist. Dies gilt fĂŒr die Anreicherung durch Butanol- oder offline Festphasenextraktion ebenso wie fĂŒr den Verdau mit Nuclease P1. Andererseits belastet bei direktem Labeling mit anschließender HPLC-Analyse ein zu hoher Anteil normaler Nukleotide die Analyse. Außerdem wird bei diesem Verfahren mit einem Unterschuß an radioaktivem ATP gelabelt. Dies fĂŒhrt zu nicht reproduzierbaren Ausbeuten und macht eine quantitative Analyse unmöglich. Deshalb mĂŒssen dringend weitere Anstrengungen unternommen werden um die normalen Nukleotide reproduzierbar von den Addukt-Nukleotiden bereits vor dem Labeln abzutrennen. Die reproduzierbare Trennung der Addukte durch HPLC ist ein ganz wesentlicher Vorteil gegenĂŒber der DĂŒnnschichtchromatografie. Allerdings ist die Nachweisempfindlichkeit im RadioaktivitĂ€tsdetektor wegen der kurzen ZĂ€hlzeiten begrenzt. Ein Peak ist maximal 2 min in der Durchflußzelle, wĂ€hrend die DC-Platte fast beliebig lang exponiert werden kann. Wir haben deshalb ein Blotting-Verfahren entwickelt, bei dem das HPLC-Eluat der HPLC-SĂ€ule auf Zellulose-Platten aufgetragen wird. Die RadioaktivitĂ€tsmessung kann dann in der gleichen Weise wie bei den DC-Platten durch Exposition von Fuji-Imaging Platten und Auswertung mit einem Fuji Bio-Imaging Analyzer vorgenommen werden. Dies höht die Nachweisempfindlichkeit um eine bis zwei GrĂ¶ĂŸenordnungen. Durch die Beschichtung der Zellulose mit einem Ionenaustascher (1% PEI-Lösung) wird verhindert, daß die Nukleotidaddukte mit dem HPLC-Eluat vom Auftragungsort wegdiffundieren und die Trennung der Peaks keine Einbußen erleidet. Anhand von Leber-DNA von Ratten, die mit 4-Aminobiphenyl (4-ABP), o-Toluidin (OTD) und Benzo[a)pyren (BP) behandelt wurden, zeigte sich, daß mit dieser Methode das HPLC-Chromatogramm nicht nur reproduziert, sondern auch eine Reihe von zusĂ€tzlichen Addukten geringerer IntensitĂ€t detektiert werden können. Öffentlichkeitsarbeit und PrĂ€sentation Mit Hilfe der DBU wurde im Dezember 1994 ein Workshop organisiert, an dem sich die meisten Arbeitsgruppen beteiligten, die sich in Deutschland mit dem 32P-Postlabeling beschĂ€ftigen. Aufgrund des guten Erfolges dieses Workshops und der anschließenden großen Nachfrage der Teilnehmer wurde 1996 ein zweiter Workshop von Prof. Wießler am DKFZ in Heidelberg ausgerichtet. Dabei wurden besonders die HPLC-Methoden ausfĂŒhrlich diskutiert. Der dritte Workshop 1997 in WĂŒrzburg am Institut fĂŒr Toxikologie, der von Prof. Eder ausgerichtet wurde, zeigte erneut, daß HPLC-Methoden immer grĂ¶ĂŸeres Interesse finden. Im Rahmen eines HPLC-Seminars unter der Leitung von Prof. Kuß, Abteilung Neurochemie der Psychiatrischen Klinik der LMU, konnten wir speziell unsere HPLC-Methode prĂ€sentieren und diskutieren. Unsere HPLC-Methode wurde ebenfalls dem Arbeitskreis: Untersuchung einer möglichen GesundheitsgefĂ€hrdung durch berufliche Exposition gegenĂŒber Zytostatika des Instituts fĂŒr Arbeits-und Umweltmedizin vorgestellt. Außerdem wurden unsere bisherigen Ergebnisse auf einem internationalen Kongreß in Kalifornien prĂ€sentiert. Nachfolgend sind die bisherigen Kurzveröffentlichungen aufgefĂŒhrt. Außerdem ist zu diesem Thema bereits eine Diplomarbeit in Chemie abgeschlossen worden und eine Doktorarbeit steht kurz vor ihrem Abschluß. Nguyen PT Specht A Schulze J Richter E (1994) Entwicklung einer HPLC-Methode zum Nachweis von 32P-DNA-Addukten von 4-Aminobiphenyl. 32P-Postlabelling Workshop, Walther-Straub-Inst.f. Pharmakol. u. Toxikol., MĂŒnchen, 2.-3.12. Nguyen P-T Specht A Richter E (1995) Detection of aromatic amine DNA adducts by 32P-postlabeling with online HPLC enrichment. 6th Int Conf on Carcinogenic/Mutagenic N-Substituted Aryl Compounds, Monterey, CA, 4.-8.11.1995 Nguyen P-T Specht A Schwaiger U Richter E (1996) Improved determination of aromatic amine DNA adducts by 32P-postlabeling with HPLC enrichment and blotting. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 353 (Suppl): R135 Nguyen P.-T., Specht A. and Richter E. (1998) Improved detection of DNA adducts by 32P-Postlabeling with online HPLC enrichment and blotting, Carcinogenesis, submitted Specht A (1994) Bestimmung von DNA-Addukten von 4-Aminobiphenyl durch 32P-Postlabelling und HPLC. Diplomarbeit aus dem Fachgebiet Biochemie der Naturwissenschaftlichen FakultĂ€t der LMU Fazit Die in dem Projekt erzielten Ergebnisse zeigen, daß das Verfahren des 32P-Postlabeling zum Nachweis der Belastung des Menschen mit kanzerogenen, umweltrelevanten Schadstoffen geeignet ist, wenn man sich die bessere Trennleistung der HPLC und die wesentlich erhöhte Nachweisempfindlichkeit durch die neuentwickelte Technik des HPLC-Blotting zunutze macht. Die von uns entwickelte Blottingmethode wird der HPLC-Analytik beim 32P-Postlabeling endgĂŒltig zum notwendigen Durchbruch verhelfen. In Verbindung mit der SĂ€ulenschalttechnik können Nachweisgrenzen erreicht werden, die denjenigen in der DC-Analytik um nichts nachstehen. FĂŒr die kommerzielle Nutzung gilt es nun ein BlottinggerĂ€t zu entwickeln und einen Hersteller zu finden, der das PEI-beschichtete Filterpapier fĂŒr die Anforderungen des Blotting optimiert. Wir sind zuversichtlich, daß diese Methode dann in der Umweltanalytik fĂŒr das Biomonitoring kanzerogener Substanzen breite Anwendung finden wird.

Übersicht

Telefon

089/2180-73-802

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Bundesland

Bayern

Fördersumme

383.773,64 €

Förderzeitraum

01.05.1994 - 30.04.1997