Projekt 02709/02

Verwendung von Glas als recyclingfÀhige Alternative zum Polystyrol in der Zellkultur

ProjekttrÀger

Institut fĂŒr angewandte ZellkulturDr. Toni Lindl GmbH
Balanstr. 6
81669 MĂŒnchenZielsetzung und Anlass des Vorhabens Etablierung von Glasflaschen aus Recyclingglas in der Zellkultur mit modernem Design und gutem Handling. TauglichkeitsprĂŒfungen fĂŒr die Verwendbarkeit von weichem Glas fĂŒr die in vitro-ZĂŒchtung von SĂ€ugerzellen und Entwicklung eines Produktionsverfahrens fĂŒr rechteckige, stapelbare Glasflachen in der Zellkultur, die denen aus Polystyrol (PS) nachempfunden sind und als recyclingfĂ€higes Glas einen Beitrag zur Verminderung von CO2-Emissionen leisten sollen. Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie Etablierung von weichem (recyclingfĂ€higem) Glas in der Zellkultur erfolgte ĂŒber TauglichkeitsprĂŒfungen mittels verschiedenartigster Zelllinien mit Hilfe diverser Zellkulturmethoden. ZunĂ€chst musste ĂŒberprĂŒft werden, inwieweit Weichglas sich im Vergleich zu PS und hartem nicht recyclingfĂ€higem Borosilikatglas (Labor- oder Duranglas) zur ZellzĂŒchtung eignet. Danach sollte eine Optimierung der OberflĂ€che des Weichglases im Hinblick auf verbesserte Anheftungs- und Wachstumseigenschaften der Zellen erfolgen, z. B. durch verschiedene Waschmethoden bzw. VergĂŒtung der OberflĂ€che mittels verschiedener chemischer Substanzen. Nachdem die vermutlich optimale OberflĂ€che des Weichglases durch eine HochtemperaturvergĂŒtung mit Ammoniumsulfat gefunden war, musste diese in weiterfĂŒhrenden Versuchen mit speziellen Zellkulturmethoden mit möglichst verschiedenartigen Zelllinien auf die generelle Zellkulturtauglichkeit ĂŒberprĂŒft werden. An Zellkulturmethoden zum Einsatz kamen die ÜberprĂŒfung der unterschiedlichsten Zellen auf Wachstum, ihre Anheftungsgeschwindigkeit, Vermehrungsfaktor und KoloniebildungsfĂ€higkeit, alles im Vergleich in erster Linie mit dem handelsĂŒblichen PS, das durch dieses Weichglas ersetzt werden soll. Als abschließende Zellkulturversuche auf dieser OberflĂ€che wurde die Transfektion von Zellen sowie die ZĂŒchtung der sehr empfindlichen und anspruchsvollen humanen primĂ€ren Endothelzellen und der humanen primĂ€ren Keratinozyten durchgefĂŒhrt, um die Eignung der opti-malen OberflĂ€che auch fĂŒr diese Zwecke zu ĂŒberprĂŒfen. Nach der Musterlieferung der Glasflaschen wurde jeweils die Praxistauglichkeit fĂŒr die Zellkultur (Verschluss, Waschfestigkeit, Mikroskopierbarkeit, Handling, Gewicht, OberflĂ€chenbeschaffenheit, etc.) geprĂŒft. Ergebnisse und Diskussion In ersten grundlegenden Versuchsreihen konnte anhand von Wachstumsversuchen gezeigt werden, dass die Zellen grundsĂ€tzlich auf Weichglas der 3. hydrolytischen Klasse ebenso gut wachsen wie auf PS bzw. hartem nicht recyclingfĂ€higem Duranglas (hydrolytische Klasse 1). Im Verlauf der verschiedenen Versuchsreihen hat sich die InnenvergĂŒtung von Weichglas mit Ammoniumsulfat (AS) als fĂŒr die Zellen geeignete OberflĂ€che herausgestellt. Anhand von Wachstumsversuchen mit sehr unterschiedlichen Zelllinien (Fibroblasten, Epithelzellen, neurale Zellen, humane Endothelzellen) konnte im direkten Vergleich auf verschiedenen OberflĂ€chen gezeigt werden, dass die Zellen auf der mit AS beschichteten WeichglasoberflĂ€che genauso gut oder teilweise sogar noch besser wachsen als auf PS. Beim Vergleich der Anheftungsgeschwindigkeit geschah dies auf der AS-OberflĂ€che etwas langsamer, jedoch war die endgĂŒltige Zellzahl davon nicht be-troffen, so dass dies keinen ernsthaften Nachteil bedeutet. FĂŒr die Untersuchung der KoloniebildungsfĂ€higkeit (Plating efficiency, PE) wurden 4 verschiedene Zelllinien (L929, CHO, WI-38, HT-29) auf unterschiedlichen OberflĂ€chen eingesetzt. In der Gesamtbeurteilung ist die PE auf der AS-OberflĂ€che der dem handelsĂŒblichen PS mindestens gleichwertig. Die Transfektion von CV-1-Zellen wurde auf PS-Platten und in AS-Flaschen durchgefĂŒhrt. Die Transfektionsauswertung ergab eine um 60 % höhere Transfektionsrate bei den AS-Flaschen. Beim Vergleich des Wachstumsverhaltens humaner primĂ€rer Endothelzellen (1. Passage) wurde auf der AS-OberflĂ€che 85 % der Zellzahl von PS (= 100 %) erreicht. Es konnte somit gezeigt werden, dass selbst unter serumfreien Bedingungen die Endothelzellen auch auf AS-behandelter WeichglasoberflĂ€che zufriedenstellend wachsen. Beim Vergleich des Wachstums humaner primĂ€rer Keratinozyten lag die erreichte Zellzahl nach 16 Tagen Kultivierung bei AS um 20 % höher als bei PS. Zusammenfassend lĂ€sst sich die Aussage treffen, dass die mit AS vergĂŒtete WeichglasoberflĂ€che nicht nur generell fĂŒr die Zellkultivierung eingesetzt werden kann, sondern sich auch fĂŒr ganz spezielle Techniken sowie fĂŒr die ZĂŒchtung hochempfindlicher Zellen mit besonderen AnsprĂŒchen als sehr gut geeignet herausgestellt hat. Parallel mit der ÜberprĂŒfung der OberflĂ€che auf Eignung in der Zellkultur wurde schon am Design der Flasche gearbeitet. Das Design und die OberflĂ€chenvergĂŒtung sind zum Zwecke der Zellkultivierung als Patent beim Deutschen Patentamt angenommen worden. Die Flaschenform ist bei der derzeitigen endgĂŒltigen Musterform derjenigen aus PS möglichst nach empfunden worden. Hier gab es unerwartete Schwierigkeiten, da es zwar prinzipiell möglich ist, rechteckige Flaschen mit dem ĂŒblichen Press-Blow- bzw. Blow-Blow-Verfahren herzustellen, diese aber den Anforderungen bezĂŒglich Planheit der KulturoberflĂ€che, des Gewichts und der Stapelbarkeit nicht entsprechen. Die ersten Musterflaschen sowohl der Fa. Heye als auch der Fa. Ernstthal waren technisch völlig unzureichend, insbesondere hinsichtlich der Planheit der KulturoberflĂ€che und damit der Ă€ußerst wichtigen Mikroskopierbarkeit der Zellen. Nach vielen weiteren enttĂ€uschend verlaufenden Kontakten mit Glasherstellern ist es uns gelungen, in Essen einen Fachmann zu finden, der uns bei der Formengebung in Bezug auf die gleichmĂ€ĂŸige Verteilung des Glases behilflich ist. Bisherige Probelieferungen durch die Fa. Wisthoff konnten zwar die Erwartungen noch nicht ganz erfĂŒllen, jedoch ist anzunehmen, dass letzten Endes die Flasche in Produktion gehen kann. Mit der Konstruktion des Verschlusses der Flasche wurde eine Firma beauftragt (Kisico GmbH), der es gelungen ist, eine sterile Abdichtung mit hydrophoben Filtern herzustellen, die zudem noch autoklavierbar ist, d. h. wieder verwendbar ist. Fazit Bei Projektabschluss lag kein praxistauglicher Prototyp vor, der in die Produktion gelangen könnte, weshalb das Vorhaben leider das Projektziel nicht erreicht.

Übersicht

Telefon

089/487774

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Bundesland

Bayern

Fördersumme

314.955,80 €

Förderzeitraum

01.09.1997 - 30.06.2001