Projekt 13169/01

örderschwerpunkt Biotechnologie: ChemBioTec: Innovatives nachhaltiges Verfahren zur Biotransformation von in Wasser un- oder schwer löslichen Verbindungen und deren Aufarbeitung bei Verwendung ionischer Flüssigkeiten als Lösungsvermittler am Beispie[…]

Projektträger

X-Zyme GmbH
Merowingerplatz 1a
40225 Düsseldorf
Telefon: 0211-3398946

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Ziel des vorliegenden Projekts war die Erarbeitung eines alternativen Lösungsmittelkonzepts zur Anwendung in einer integrierten Aufarbeitung im Produktionsschritt. Die hier zugrundeliegende Strategie beruhte auf der Kombination sogenannter ionischer Flüssigkeiten (IL) als Lösungsvermittler mit überkritischen Fluiden als Extraktionsmittel, die den Vorteil einer kontaminationslosen Produktextraktion, einer umweltfreundlichen Rezyklierung der Zusätze sowie eines erweiterten Einsatzes von Biokatalysatoren mit sich bringt. Zudem wurden neue Ansätze für die biokatalytische Umsetzung von in Wasser unlöslicher oder schwerlöslicher Verbindungen und deren Aufarbeitung angestrebt. Das vorgestellte Konzept sollte für die biokatalytische Synthese von enantiomerenreinem 2-Octanol herangezogen werden.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie Biokatalyse ist aufgrund ihrer Effizienz bei der chemischen Synthese nicht mehr wegzudenken. Sie bietet für viele Prozesse eine nachhaltige Alternative zu chemischen Synthesen. Allerdings stellt die unabdingbare wässrige Umgebung eine wesentliche Einschränkung für die Anwendbarkeit der Biokatalyse dar. Dies gilt insbesondere für technisch relevante Prozesse, da die erreichbare Raum-Zeit-Ausbeute und Produktivität von der Löslichkeit und der dadurch bedingten maximalen Reaktionsgeschwindigkeit abhängt.
Zwei Lösungsansätze und deren Kombination wurden für diese Problematik vorgeschlagen:
- IL erschienen aufgrund ihrer einstellbaren Eigenschaften geeignet, die oben genannten Probleme
zu überwinden. Für die anschließende Extraktion oder die integrierte Aufarbeitung können gezielt
Systeme gesucht werden, die die gewünschten lösungsvermittelnden Eigenschaften aufweisen,
ohne bei der Extraktion aus der wässrigen Phase zu stören.
- Für scF als Extraktionsmittel war zu erwarten, dass die IL als Lösungsvermittler nicht extrahiert
werden. Es konnte in Vorarbeiten gezeigt werden, dass IL aufgrund ihres ionischen Charakters
und des nicht messbaren Dampfdrucks mit scF nicht extrahiert werden.
- Die Kombination dieser beiden Fluide eröffnet die Möglichkeit, die jeweiligen Vorteile miteinander
zu verbinden und durch die Vermeidung von Abfällen ein erhebliches Umweltentlastungspotenzial
zu schaffen.


Ergebnisse und Diskussion

Im Rahmen des Projekts war es möglich, hochaktive und enantioselektive R-ADH-Mutanten zu erzeugen, deren Anwendbarkeit in Anwesenheit ionischer Flüssigkeiten bestätigt wurde. Mit Hilfe umfangreicher Optimierungsprozesse konnten die Aktivitäten bis zu einem Grad der technischen Anwendbarkeit gesteigert werden. Die Produktion der Biokatalysatoren konnte zum Projektende bereits im Rahmen von 300L-Fermentationen erfolgen. Von besonderer Wichtigkeit war die Identifizierung verschiedener IL, die eine ausreichende Kompatibilität mit dem Biokatalysator aufweisen. Zu diesem Zweck wurde zunächst der Einfluss der verschiedenen IL auf die Kompatibilität mit einer Alkoholdehydrogenase untersucht. Dabei wurden besonders mit hydroxyfunktionalisierten tertiären Ammoniumverbindungen gute Ergebnisse erzielt. Die meisten dieser IL sind - bei einer Dosierung von 10 Vol % im Reaktionsmedium - in der Lage das Enzym in Lösung zu stabilisieren, ohne seine Aktivität negativ zu beeinflussen. Darüber hinaus wurden verschiedene Methoden zur Cofaktorregenerierung (elektrochemisch, enzymgekoppelt mit einer Malatdehydrogenase bzw. einer Glucosedehydrogenase) untersucht. Es zeigte sich, dass die Cofaktorregnerierung mit Hilfe der GDH für unsere Zwecke am besten geeignet ist. Anhand der Voruntersuchungen wurde die Auswahl an möglichen IL reduziert. Für eine IL wurden Synthesen mit 10, 25 und 50 Vol %-Anteile durchgeführt, bei denen sich jedoch im Vergleich zur Synthese im reinen Puffer keine Verbesserung der Produktivitäten zeigte. Detaillierte Kinetikuntersuchungen ergaben, dass für die ADH eine deutliche Produktinhibierung vorliegt, weshalb die Zugabe eines Lösungsvermittlers zur Verbesserung der Substratlöslichkeit nur dann vorteilhaft ist, wenn der Lösungsvermittler nicht auch die Produktlöslichkeit heraufsetzt. Da für das untersuchte Enzym die maximale Reaktionsgeschwindigkeit in Puffer schon bei einer Konzentration kleiner 8 mM (= maximale Löslichkeit im verwendeten Puffer) erreicht war, während gleichzeitig aufgrund der geringen Löslichkeit des Produkts zu hohe Konzentrationen desselben vermieden werden konnten, wurden zusätzlich Versuche in reinem Puffer und mit Substrat als zweiter Phase durchgeführt. In diesem Setup konnten folgende Ergebnisse realisiert werden: STY = 800 mmolL-1d-1 (= 103 gL-1d-1), ee > 99,9 %, TTNADH = 33300, TTNGDH = 13100, TTNNADP+ = 8000.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Die im Rahmen des DBU-Kooperationsprojekts gewonnenen Erkenntnisse wurden auf der Messeveranstaltung ChemSpec 2008 CPhI 2008 präsentiert. Des Weiteren wurden die Ergebnisse im Rahmen des Graduiertenkollegs BioNoCo vorgestellt. In naher Zukunft werden Teile dieses Projektes auf der ACHEMA 2009, auf der DECHEMA-Tagung Biokatalyse: Neue Verfahren, neue Produkte sowie auf der Biotrans 2009 präsentiert. Die Ergebnisse der elektrochemischen Untersuchungen werden in F. Hildebrand, S. Lütz, Chem. Europ. J. 2009, accepted. bzw. in C. Kohlmann, et al., J. Am. Chem. Soc. 2009, submitted. veröffentlicht. Außerdem sollen auch die Ergebnisse der Enzymcharakterisierung in Gegenwart ionischer Flüssigkeiten und die Erkenntnisse bezüglich der Synthese von 2-Octanol in einem wissenschaftlichen Artikel publiziert werden. Für die Verwendung ionischer Flüssigkeiten als Stabilisatoren für Nicotinamidcofaktoren wurde eine Patentanmeldung (Kohlmann C, Greiner L, Lütz S; DE 10 2008 061 866.7, 15.12.2008. Verwendung von ionischen Flüssigkeiten sowie Sensor. Germany.) eingereicht. Eine weitere Patentanmeldung bezüglich des Einsatzes ionischer Flüssigkeiten wird derzeit noch geprüft.


Fazit

Ionische Flüssigkeiten stellen interessante Additive für die Biokatalyse dar. So können durch den Einsatz geeigneter IL die Enzym- und Cofaktorstabilitäten deutlich gesteigert oder auch verbesserte Substratlöslichkeiten realisiert werden. Die Kombination dieser Additive mit einer selektiven Produktextraktion mit Hilfe von überkritischen Fluiden stellt eine umweltentlastende Alternative zur chemischen Darstellung enantiomerenreiner Alkohole dar. Im Hinblick auf die zunehmende Bedeutung der Biokatalyse bei der Herstellung chiraler Verbindungen kann diese Ergänzung der konventionellen chemischen Verfahren als zukunftsweisend eingeschätzt werden und mit großer Wahrscheinlichkeit in die gängige Praxis biotechnologischer Produktionen integriert werden. Im Fall der enantioselektiven Reduktion von 2-Oktanon mit der verwendeten ADH ist allerdings kein Zusatz an IL nötig um prozessrelevante Produktivitäten zu erzielen. In diesem Fall scheint der Einsatz des Substrats als zweite Phase besonders vielversprechend. Das gebildete Produkt kann zwar durch Extraktion mit überkritischem CO2 abgetrennt werden, da es sich jedoch bei Konzentrationen > 6 mM als separate Phase ausbildet, ist auch eine Abtrennung durch Phasentrennung möglich. So ist man in der Lage auf zusätzliche Additive und komplexe Reaktionsschritte zu verzichten, weshalb das Verfahren besonders umweltfreundlich und ressourcenschonend scheint. Das Konzept der Verwendung ionischer Flüssigkeiten als Löslichkeitsvermittler für die biokatalytische Synthese chiraler Verbindungen mit anschließender Produktextraktion mittels überkritischer Fluide wird derzeit für die Synthese weiterer chiraler Alkohole untersucht.

Übersicht

Fördersumme

237.475,00 €

Förderzeitraum

01.03.2007 - 28.02.2009

Internet

www.x-zyme.com

Bundesland

Nordrhein-Westfalen

Schlagwörter

Klimaschutz
Ressourcenschonung
Umweltforschung
Umwelttechnik