Projekt 13145/01

örderschwerpunkt Biotechnologie: Etablierung innovativer umweltfreundlicher Synthesetechniken zur nachhaltigen Produktion von Chemikalien durch biokatalytische Oxyfunktionalisierung in Kombination mit innovativen Ansätzen der integrierten Produktauf[…]

Projektträger

K.D. Pharma Bexbach GmbH
Am Kraftwerk 6
66450 Bexbach
Telefon: 06826-3006

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Biokatalytische Oxyfunktionalisierungen sind, dank milder Reaktionsbedingungen, dem Verzicht auf Edel- und Schwermetallkatalysatoren und der hohen chemischen Selektivität, hinsichtlich einer nachhaltigen Umweltentlastung eine vielversprechende Alternative zu chemisch-katalytischen Prozessen. Die erfolgreiche industrielle Anwendung der Biokatalyse bedingt jedoch hohe Raum-Zeit-Ausbeuten und diese wiederum genügend hohe Biokatalysatoraktivitäten und -stabilitäten. Die Isolierung und Gewinnung der oxyfunktionalisierten Produkte durch effektives und umweltverträgliches Downstream-Processing (DSP) ist eine weitere Grundvoraussetzung für die industrielle Realisierung biokatalytischer Verfahren. Im vorliegenden Projekt sollen Aktivität und Stabilität (NADH-Regeneration) eines Ganzzell-Biokatalysators zur stereospezifischen Styrolepoxidierung durch Metabolismusanalyse und Metabolic Engineering untersucht und optimiert werden. Gleichzeitig soll ein integriertes Prozessführungskonzept bestehend aus Trenntechnologien in überkritischem/flüssigem CO2 eine effiziente und umweltfreundliche Produktaufarbeitung aus dem bestehenden Emulsionsprozess erlauben. Für biokatalytische Hydroxylierungen soll außerdem eine weitere Enzymklasse (Dehydrogenasen) mit dem Potenzial, Limitationen durch Sauerstofftransfer und Kofaktorregeneration zu vermeiden, evaluiert und in das breit angelegte Prozessführungskonzept integriert werden.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenFür die Styrolepoxidation werden rekombinante, Styrolmonooxygenase (StyAB) enthaltende E. coli in Zweiphasensystemen mit verschiedenartigen organischen Phasen eingesetzt. Hierfür soll die Ökoeffizienz analysiert und optimiert werden. Die metabolische Flussanalyse soll mögliche Limitationen identifizieren. Genetic Engineering im Bereich kofaktorregenerierender Enzyme und/oder deren Regulation soll höhere Produktivitäten und Stabilitäten erlauben. Für die Anwendung der Dehydrogenasen werden geeignete Expressionssysteme entwickelt und in geeigneten Wirten eingesetzt. Die Prozessentwicklung umfasst hier neben dem DSP auch Kultivations- und Reaktionsbedingungen. Zur Produktextraktion mit überkritischem CO2 aus der Emulsion wird eine Kombination aus SFE (Supercritical Fluid Extraction) und SFC (Supercritical Fluid Chromatography) entwickelt. CO2 soll auch zur Phasentrennung zum Einsatz kommen.


Ergebnisse und Diskussion

Biokatalytische Oxyfunktionalisierungen sind, dank milder Reaktionsbedingungen, dem Verzicht auf Edel- und Schwermetallkatalysatoren und hoher chemischer Selektivität, hinsichtlich einer nachhaltigen Umweltentlastung eine vielversprechende Alternative zu chemisch-katalytischen Prozessen. Innerhalb des hier vorgestellten Projekts wurde beispielhaft die Ökoeffizienz eines in einem Vorprojekt (AZ 13095) entwickelten und auf rekombinanten E. coli basierenden Prozesses zur enantioselektiven Styrolepoxidierung durch die BASF und extern durch E. Heinzle (Universität Saarbrücken) evaluiert. Im Vergleich zur chemischen Prozessalternative schnitt der Bioprozess ökonomisch in beiden Studien ökologisch jedoch nur in der Studie aus Saarbrücken positiv ab. Die Studien sahen in Bezug auf das im Zweiphasenprozess verwendete Lösungsmittel und das Wachstumssubstrat großes Verbesserungspotenzial. Biodiesel bzw. Ethyloleat und Glyzerin wurden erfolgreich als Alternativen zu BEHP und Glukose eingesetzt. Dabei wurden über 8-9 h Reaktionszeit durchschnittliche Produktivitäten von 3-5 g/Ltot/h erreicht. Die Analyse der Ökoeffizienz zeigte, dass sich diese Verfahrensänderungen in der Tat sehr positiv auf die Ökoeffizienz des Prozesses auswirken.
Metabolische Flussanalysen zeigten einen sehr hohen biokatalysebedingten NADH-Verbrauch, welcher zu einer NADH-Limitation in wachsenden Zellen führte. Aufgrund dessen wurde eine Zitratzyklusmutante getestet, die in der Tat vielversprechende Resultate wie die Reduzierung der Essigsäureproduktion und die Erhöhung der Produktivität zeigte.
Mit der Chance Limitationen durch O2-Transfer und NADH zu umgehen, wurden Wasser einbauende Dehydrogenasen in verschiedenen Pseudomonas-Stämmen zur Hydroxylierung von N-Heteroaromaten mit einer Aktivität von bis zu 54 U/gCDW erfolgreich eingesetzt. Für 4-Hydroxychinaldin wurde zudem ein vielversprechender Zweiphasenprozess entwickelt.
Als eine Hauptlimitation für die industrielle Implementierung zweiphasiger Bioprozesse gilt vor allem die aufwändige Phasentrennung. Hier wurde überkritisches CO2 sowohl zur Phasentrennung als auch zur Produktextraktion erfolgreich eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass eine Phasentrennung der stabilen Emulsion mit überkritischem Kohlendioxid möglich und technisch realisierbar ist. Zudem wurde eine auf einer Hochdrucksichtzelle basierende Versuchsanlage aufgebaut, mit der die Löslichkeiten der beteiligten Komponenten in Kohlendioxid ermittelt werden konnten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass es möglich ist, das Wertprodukt direkt aus der organischen Phase zu extrahieren.
Für die kontinuierliche Aufarbeitung der Emulsion bzw. der organischen Phase wurde eine präparative SFE/SFC-Anlage entwickelt und gebaut. Mit dieser Anlage und auf der Basis der ermittelten Extraktionsdaten konnte gezeigt werden, dass das Wertprodukt über mehrere Trennstufen effizient extrahiert werden kann. Die gleichzeitige Extraktion des Nebenprodukts (2-Phenylethanol) sowie des Induktors (n Oktan) erlaubt eine effiziente Rückführung des organischen Lösungsmittels (BEHP).


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Eine Publikation mit dem Titel NADH Availability Limits Asymmetric Biocatalytic Epoxidation in Growing Recombinant Escherichia coli wurde in AEM veröffentlicht. Weitere Publikationen bezüglich DSP und Ökoeffizienz sind geplant. Präsentationen bezüglich des Projekts umfassen Vorträge und Poster an verschiedenen Tagungen, darunter die GVC/DECHEMA-Jahrestagung, 27.09.2006, Wiesbaden, die European BioPerspectives 2007, 31.05.2007, Köln, die Tagung High Pressure meets Advanced Fluids, 10.-11.03.2008, Aachen, das 11. European Meeting on Supercritical Fluids, 04.-07.05.2008, Barcelona, die Biotrans, 08.-13.07.2007, Oviedo, das 2. International Symposium on Biothermodynamics, 21.-22.02.2008, Frankfurt, die Gordon Research Conference on Biocatalysis, 06.-11.07.2008, Smithfield, RI, USA, das 7th European Symposium on Biochemical Engineering Science, 07.-10.09.2008, Faro, Portugal, und die European BioPerspectives 2008, 07.-09.10.2008, Hannover.


Fazit

Ethyloleat und Glyzerin wurden während der Styrolepoxidation erfolgreich als Alternativen zu BEHP und Glukose eingesetzt. Diese Änderungen wurden bezüglich Ökoeffizienz positiv reevaluiert. Die metabolische Flussanalyse zeigte NADH-Limitation in wachsenden Zellen. Das Testen einer Zitratzyklusregulationsmutante ergab vielversprechende Resultate wie die Reduzierung der Essigsäureproduktion und die Erhöhung der Produktivität. Wasser einbauende Dehydrogenasen zeigten hohe Aktivitäten in Ganzzellkatalysatoren. Für 4-Hydroxychinaldin wurde ein vielversprechender Zweiphasenprozess entwickelt. Die stabile Emulsion konnte mit komprimiertem CO2 effizient gebrochen werden. Mit einer neu gebauten SFE/SFC-Anlage konnte gezeigt werden, dass das Wertprodukt über mehrere Trennstufen effizient extrahiert werden kann. Die interdisziplinäre Zusammenarbeit in diesem Projekt hat somit wichtige Erkenntnisse und Entwicklungen hin zu einer Technologieplattform für nachhaltige integrierte Bioprozesse erbracht.