Projekt 13133/01

Förderschwerpunkt Biotechnologie: ICBio: Erstmalige Verwertung Cofaktor-unabhängiger Decarboxylasen für die umweltentlastende und ressourcenschonende Produktion doppeltsubstituierter Essigsäurederivate

Projektträger

Universität Duisburg-Essen Institut für Grenzflächen-Biotechnologie Molekulare Enzymtechnologie
Forsthausweg 2
47057 Duisburg
Telefon: 0203-379-4382

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Ziel dieses Projekts ist es, neue Enzyme bereitzustellen, die für eine biotechnologische Anwendung in der chemisch/pharmazeutischen Industrie geeignet sind und zur Umweltentlastung beitragen. Der be-sondere Schwerpunkt des Projekts liegt dabei auf Decarboxylasen, die ohne Co-Enzym eine Decarboxy-lierung doppeltsubstituierter Malonsäurederivate ermöglichen. Die Erschließung und Verwertung neuer Enzyme dieser Enzymklasse (EC 4.1.1.) ist als eine wichtige Alternative gegenüber dem chemischen Zugang zu einer Vielzahl an optisch aktiven ?-substituierten Carbonsäuren anzusehen (Ohta, Adv. Bio-chem. Eng Biotechnol. 63, 1999, 1-20). Darüber hinaus sollen neben den Malonsäuredecarboxylasen zusammen mit der Degussa AG Aminosäuredecarboxylasen identifiziert und zu einer Verwertung geführt werden. Decarboxylasen sind begehrte Biokatalysatoren, da sie eine Vielzahl unterschiedlicher Reaktionen spezifisch (regio- und enantioselektiv) und mit einer hohen Umsatzzahl katalysieren können. Aus diesem Grund bietet sich ihr Einsatz in der chemischen Synthese an.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten Methoden- Screening einer Mutantenbank der Decarboxylase aus Bordetella bronchisepticus (AMDase)
- Klonierung von homologen Genen nach Datenbankvergleich
- Anreicherung von Umweltproben
- Detektion von aktiven Isolaten mit Hilfe eines pH-abhängigen Verfahrens


Ergebnisse und Diskussion

Ziel des Projekts war die Isolierung und biochemische Charakterisierung von Co-Faktor-unabhängigen Arylmalonsäure-Decarboxlyasen und von ausgewählten Aminosäuredecarboxylasen. Zu Beginn des Projektes lag in den Datenbanken lediglich eine Co-Faktor-unabhängige Arylmalonsäure-Decarboxlyase vor (GB # 728844). Wir haben es in der relativ kurzen Projektlaufzeit geschafft zumindest einen weiteren Organismus zu identifizieren, bei dem eine Co-Faktor-unabhängige Decarboxylase vorliegt. Die Co-Faktorunabhängigkeit wurde in ersten Tests mit nativem Enzym verifiziert. Darüber hinaus wurden vier weitere Organismen isoliert, die mit hoher Wahrscheinlichkeit über derartige Enzyme verfügen. Allerdings sind die gemessenen Aktivitäten in diesen vier Organismen niedrig im Vergleich zu unserem ersten E-Isolat (Variovorax sp.HH01). Überraschend ist die extrem hohe Aktivität in den Rohextrakten des Variovorax-Isolats im Vergleich zu allen anderen Isolaten und im Vergleich zur bekannten Decarboxyla-se aus Bordetella (Alcaligenes) bronchisepticus. Aufgrund der hohen Aktivitäten im Variovorax-Isolat wurde zunächst damit begonnen, dieses Enzym zu charakterisieren. Diese Arbeiten sind jedoch auf-grund der nur geringen Fördersumme, die dem Hamburger und Jülicher Labor zur Verfügung standen noch nicht zum Abschluss gekommen. Immerhin ist es aber gelungen, die korrespondierende DNA-Sequenz zu ermitteln und erste Versuche zur Expression in E. coli durchzuführen. Ähnlich positiv ist die Ergebnislage in Bezug auf die gefundenen Aminosäuredecarboxylasen zu beurteilen. Beide Enzyme liegen zudem bereits in rekombinanter Form vor. Von daher kann man davon ausgehen, dass eine Überexpression und biochemische Charakterisierung hier zügiger voranschreiten wird als bei der ausgewählten AMDase. Ausgehend von diesen Arbeiten wird es das Ziel der weiteren Arbeiten sein, das jeweilige Protein rekombinant zu produzieren und eine Patentanmeldung bzw. Verwertung zu erreichen.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Leggewie, C., Grooters, M., Kircher, M., Ayguen, H., Jaeger, K.-E., Streit, W.R. (2006): Isolation of novel decarboxylases for the production of double substituted acetic acid derivatives. Tagung Biocat, Hamburg, Germany, Posterpräsentation
Horn, S, Leggewie, C., Grooters, M., Kircher, M., Ayguen, H., Jaeger, K.-E., Streit, W.R. (2006): Isolation of novel decarboxylases for the production of double substituted acetic acid derivatives. VAAM -Tagung 2007 und 2008
Biotechnica 2007
Streit, W.R.: Dechema Jahrestagung 2007, Wiesbaden. Vortrag


Fazit

Es ist uns gelungen, eine neue Aryl-Malonsäuredecarboxylase zu identifizieren. Allein dies ist positiv zu werten, da es bisher nur einen Genbankeintrag für ein funktionales Enzym gibt. Dadurch ergeben sich jetzt neue Möglichkeiten in Bezug auf die Charakterisierung der Substratspezifitäten und andere bio-technologisch wichtige Parameter dieser Enzymklasse. Auch die Arbeiten zu den Aminosäuredecarboxylasen wurden durch die Isolierung und teilweise biochemische Charakterisierung von zwei neuen Enzymen abgeschlossen. Alle Arbeiten werden im Rahmen von Diplomarbeiten und Dissertationen in den beiden Universitätsgruppen weitergeführt, um Decarboxylasen als Biokatalysatoren weiter zu erschließen und für biotechnologische Anwendungen nutzbar zu machen. Eine Patentierung der AMDase (AmdA) aus Variovorax sp. HH01 sowie des benachbarten Gens, der Racemase (AmdC), ist zudem in Vorbereitung. Allerdings fehlen hierzu noch einige biochemische Tests, die erst in den kommenden Monaten durchgeführt werden können.

Übersicht

Fördersumme

244.361,00 €

Förderzeitraum

01.09.2005 - 28.02.2008

Bundesland

Nordrhein-Westfalen

Schlagwörter

Umwelttechnik