Projekt 13077/01

Förderschwerpunkt Biotechnologie: InnovationsCentrum Biokatalyse ICBio: Entwicklung pflanzlicher Bioreaktoren zur nachhaltigen Produktion von Biopharmazeutika

Projektträger

PLANTON GmbH
Gewerbegebiet Boelckestr. Groß Hasselrod 2
24159 Kiel
Telefon: 0431-38015-0

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Die Überexpression in pflanzlichem Gewebe (molecular farming) ermöglicht die Entwicklung eines biotechnologischen Verfahrens zur nachhaltigen Produktion antimikrobieller Peptide - bei verringertem Energieeinsatz und gleichzeitig verbesserter Produktqualität. Darüber hinaus können aber auch andere Biopharmazeutika umweltschonend im pflanzlichen System hergestellt werden. Die Planton GmbH plant, die im Rahmen des Projektvorhabens erzeugten Substanzmengen für erste präklinische Studien einzusetzen, um somit die Entwicklung von HBD-2 und HBD-3 zu einem Medikament zu erzielen.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenAntimikrobielle Peptide sind eine neue Klasse antibiotisch wirksamer Substanzen, die eine vielversprechende Alternative zu herkömmlichen Antibiotika darstellen. Ziel des hier beantragten Projekts ist die Entwicklung eines ressourcen- und umweltschonenden Verfahrens zur Produktion der humanen antimikrobiellen Peptide HBD-2 und HBD-3, die der Klasse der ß-Defensine angehören. Zur Nutzung dieser Peptide für die Entwicklung einer neuen Generation von antibiotisch wirksamen Medikamenten in der klinisch-pharmazeutischen Praxis bedarf es großer Mengen (kg bis to-Mengen) dieser Substanz. Die Isolation der Peptide aus humanem Gewebe liefert keine ausreichenden Mengen und ist aus medizinischen wie ethischen Gründen problembehaftet. Die großtechnische Gewinnung mittels gentechnischer Methoden in Fermentationsanlagen ist teuer (> 1000 US$ pro mg in Säugetierzellkultursystemen) und energetisch aufwändig (Zellen müssen gefüttert und temperiert werden, Anlagen müssen sterilisiert werden). Außerdem ist die Produktion in mikrobiellen Systemen aufgrund der antimikrobiellen Aktivität des Moleküls problematisch. Der methodische Ansatz zielt auf die Erzeugung gentechnisch veränderter Pflanzen ab, die gezielt in definierten Organen und subzellulären Kompartimenten rekombinantes ß-Defensin pro-duzieren. Dazu soll im Rahmen des beantragten Vorhabens ein optimiertes Expressionssystem entwi-ckelt werden.


Ergebnisse und Diskussion

Im Rahmen des vorliegenden Projekts sollten zwei Ziele verfolgt werden. Erstens die Entwicklung und Optimierung eines ressourcenschonenden und nachhaltigen pflanzlichen Produktionsverfahrens für antimikrobielle Peptide humanen Ursprungs und zweitens die Verwendung erster Substanzmengen zur Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität der neu produzierten rekombinanten Moleküle. Um diese Ziele zu realisieren, wurden fünf Arbeitspakete (AP) geschnürt:
Arbeitspaket 1: Aufbau neuer Expressionskassetten
Es wurden 26 Expressionskassetten kloniert, in den binären Vektor inseriert und in die Kartoffel transfor-miert (Meilenstein 1 erreicht).
Arbeitspaket 2: Identifizierung neuer Promotoren
Es wurde eine Mutanten-Kollektion aus Kartoffelpflanzen, die mit einem promotorlosen GUS-Gen transformiert wurde, etabliert, um neue knollen- und artspezifische Promotoren zu selektieren. Hierzu wurden ca. 2000 transgene Linien erzeugt, die mittels GUS-Test und molekularer Methoden analysiert wurden. Es konnten Kandidatensequenzen isoliert werden, von denen zurzeit genomische Klone >1kb isoliert werden. Beim Aufbau der Expressionskassetten konnte ein artfremder Promotor selektiert werden (PlantonPro1), der eine 10-100fach höhere Expression als der 35S-Promotor aus dem CaMVirus und darüber hinaus eine knollenspezifische Aktivität aufweist. Aufgrund dieser Tatsache wurde die Anzahl der erstell-ten Kartoffellinien nicht weiter erhöht (Meilenstein 2 weitgehend erreicht).
Arbeitspaket 3: Erstellung transgener Pflanzen
Je Konstrukt wurden mindestens 50 transgene Kartoffellinien erzeugt. Annähernd die gleiche Anzahl wurde im Gewächshaus angezogen und die Knollen geerntet Die erstellten Pflanzen zur Produktion der rekombinanten Defensine wurden per Western- und ELISA-Analyse untersucht, um ihren Gehalt an rekombinantem Protein zu bestimmen. Dabei wurde ein Genotyp mit einer Expression von etwa 10 30 mg für das antimikrobielle Peptid HBD-2 je kg Kartoffelknolle selektiert (Meilenstein erreicht).
Arbeitspaket 4: Aufreinigung der rekombinanten Peptide aus den Pflanzen
Der in Arbeitspaket 3 selektierte Genotyp wird für die von der Firma PLANTON entwickelte großtechnische Aufreinigung von HBD-2 verwendet. Ein effizienter Aufreinigungsprozess wurde etabliert, in dem das HBD-2 mit einer hohen Reinheit (> 97 %) aus der Knolle extrahiert wird (Meilenstein erreicht). Die Aufreinigung für das HBD-3 Peptid konnte nicht realisiert werden. Es wurden jedoch transgene, HBD-3 exprimierende Pflanzen erzeugt, deren Analyse noch nicht abgeschlossen ist.
Arbeitspaket 5: Antimikrobielle Tests mit den rekombinanten Peptiden
Die weitere Aufreinigung erfolgte beim Projektpartner II, der mit dem hochreinen HBD-2 Peptid die antimikrobiellen Tests etablierte und durchführte (Meilenstein erreicht). Die ersten Testergebnisse zeigten, dass rekombinantes HBD-2 vorwiegend gegen humanpathogene gramnegative Bakterien und gegen Pilze wirkt. Eine Wirkung bei grampositiven Keimen erfolgte offensichtlich nur bei einer sehr hohen Konzentration. Erstaunlicherweise zeigte sich eine sehr starke Wirkung gegen Acinetobacter, der ein Problemkeim insbesondere auf Intensivstationen und damit bei nosokomialen Infekten ist. Ein System für antimikrobielle Tests von ß-Defensin-3 wurde ebenfalls durch Projektpartner II entwickelt (Meilenstein er-reicht).


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Veröffentlichungen
- in Vorbereitung für Nature Biotechnology: Expression of recombinant human ß-Defensin (HBD-2) in potato tubers effective against multidrug resistant microbes
- FAZ, Sonderbeilage Biotechnologie, 07.10.2003
- Transkript, Sonderband Nachhaltige Biokatalyse 2003
- Ernst & Young, Biotechnologie Report Zeit der Bewährung 2003
Fachvorträge
19.09.02 Biotech Corporation, Schwedisches Generalkonsulat, Hamburg
23.09. - 25.09.02 Botanikertagung Freiburg
28.10.02 Dechema Regional-Kolloquium, Luckenwalde, Neue Protein-Expressionssysteme für die Biotechnologie und Medizin
28.11.02 HiTechTage, Hamburg
21.05. - 23.05.03 Achema, Frankfurt
30.11. - 03.12.04 Natural Peptides to Drugs, Zermatt, Schweiz
Messen, Konferenzen
30.09. - 01.10.02 European Biotechnology Symposium, München
16.03. - 19.03.03 Conference on Plant Made Pharmaceuticals, Québec, Kanada
27.04. - 02.05.03 4th International Gordon Research Conference on Antimicrobial Peptides, Il Ciocco, Barga, Italien
22.06. - 25.06.03 Bio2003, Washington, USA
07.10. - 09.10.03 Biotechnica, Hannover
20.10. - 21.10.03 BMBF-Biotechnologie-Tage, Leipzig
08.12.03 1. Planton Symposium über HBD-2, Kiel
06.06. - 09.06.04 Bio2004, San Francisco, USA


Fazit

Die Optimierung der HBD-2 Produktion wird auf dem eingeschlagenen Weg fortgesetzt. Darüber hinaus war die Expression von HBD-3 in Pflanzen ein wichtiger Schwerpunkt für die Endphase des Projekts. Wie im Ergebnisteil beschrieben, konnte eine HBD-3 Expression in den erstellten Kartoffellinien nachgewie-sen werden. Erste Ergebnisse mit diesem Molekül, das aus menschlichem Gewebe aufgereinigt wurde, zeigten, dass das Molekül eine starke Aktivität gegen grampositive Keime ausübt und damit HBD-2 her-vorragend ergänzt. Gleichzeitig ist dieses Molekül allerdings wesentlich kationischer (pI 11) als HBD-2, worauf sich sicherlich ein Großteil der Schwierigkeiten bei der heterologen Expression und der Identifikation zurückführen lassen. Bei HBD-3 handelt es sich um einen potenziellen Wirkstoff, der vor allem im to-pischen Anwendungsbereich gegen grampositive Keime ein großes Marktpotenzial besitzt.