Projekt 13048/01

Förderschwerpunkt Biotechnologie: Entwicklung eines innovativen biotechnologischen Verfahrens zur Herstellung bioabbaubarer Polymere durch erstmaligen Einsatz rekombinanter Hefen

Projektträger

Helmholtz-Zentrum für Umweltforschung GmbH - UFZSektion Umweltmikrobiologie
Permoserstr. 15
04318 Leipzig
Telefon: 0341/235-2225

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Eine kommerzielle Nutzung mikrobiell erzeugter Produkte, wie Polyhydroxyalkanoaten (PHA), im Sinne einer Umweltvorsorge erscheint auf Grund ihrer Eigenschaften, insbesondere wegen ihrer biologischen Abbaubarkeit, und ihrer vielseitigen Anwendungsmöglichkeiten sinnvoll und notwendig. Sie so preiswert zu produzieren, dass sie in der Konkurrenz mit eingeführten Kunststoffen wie Polypropylen oder Polyethylen bestehen, ist eine große Herausforderung an bio-, natur- und ingenieurwissenschaftliche Disziplinen. Weltweit werden Anstrengungen unternommen, dieses Ziel zu erreichen. Sie bestehen in der weiteren Optimierung vorliegender innovativer Verfahren sowie bekannter bakterieller Produzenten und im Screening nach neuen Produzenten. Dabei stellt sich die Frage, wie gut es gelingt, Organismen, die sich bereits in anderen biotechnischen Prozessen bewährt haben und Vorzüge aufweisen, für die Synthese von PHA durch gentechnische Maßnahmen aufzubereiten. Dazu zählt unter anderem die Backhefe Saccharomyces cerevisiae. Sie zur PHA(B)-Synthese zu befähigen, zu der sie als Wildtyp nicht in der Lage ist, wurde bereits erprobt. Dieser Projektvorschlag favorisiert zwei sog. nicht konventionelle Hefen: Arxula adeninivorans, die molekularbiologisch sehr gut untersucht ist und wofür ein Expressionssystem vorliegt, und die oleogene Hefe Debaryomyces hansenii, letztere, da sie bereits über eine metabolisch-regulatorische Prä-Disposition verfügen dürfte. Aufgabe war es, I) durch transformative Übertragung diese Spezies zur PHB-Synthese zu befähigen, II) die Expression und Leistung(sfähigkeit) der Transformanten zu analysieren und iii) Methoden zum Aufschluss der Zellen und damit zur Gewinnung von PHA zu erproben.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenI): Die einzelnen PHB-Gene von R. eutropha (ß-Ketothiolase, Acetoacetyl-CoA-Reduktase, PHB-Synthase)bzw. das PHB-Synthasegen von M. extorquens wurden sowohl in die Hefe Saccharomyces cerevisiae als Hefe-Modellsystem als auch in Arxula adeninivorans (als einem Modellobjekt für die heterologe Expression in einem Nicht-Saccharomyces-Stamm) und in die Fetthefe Debaryomyces hansenii übertragen und dort exprimiert. Durch Nutzung verschiedener Arxula-Stämme ließ sich ein möglicher Einfluss der Zellmorphologie auf die Produktbildung untersuchen. Für die Expression in Debaryomyces hansenii mußte zunächst ein Expressionssystem entwickelt werden. Neben dem Nachweis der Aktivitäten der PHB-Enzyme wurde PHB nachgewiesen. Die Untersuchungen zur Expression in D. hansenii wurden, wie bei A. adeninivorans beschrieben, durchgeführt. und
II): Die rekombinanten Hefen A. adeninivorans D. hansenii wurden batchwise und kontinuierlich vermehrt und die Produktbildung versucht zu provozieren bzw. zu stimulieren.
Die Experimente wurden in Schüttelkolben und in Bioreaktoren (Fermentoren) durchgeführt, nur wenige im zig-Liter-Maßstab. Die Ergebnisse im kleinen (Labor-)Maßstab ließen dieses nicht angezeigt er-scheinen. Analysiert wurden die spezifische Wachstumsrate, die spezifische Produktbildungsrate, die Ausbeute an Biomasse und PHB sowie die Polymerkonzentrationen bei Verwendung verschiedener Kohlenstoffquellen. Weiterhin wurde unter Nutzung von Effektoren versucht zu klären, welche Stoffwechselwege mit der PHB-Synthese konkurrieren (Frage nach dem Bildungsweg für den PHB-Präkursor 3-Hydroxybutyryl-CoA) und ob Konkurrenzen zurückgedrängt werden können. Gleichzeitig wurde das gebildete Polymer hinsichtlich seiner Zusammensetzung gaschromatographisch analysiert. III): Zur Gewinnung des intrazellulär gebildeten wie deponierten Polymers ist es notwendig, die Zellen zu desintegrieren. Versuche zum Zellaufschluss wurden durchgeführt. Benutzt wurde der für Bakterien entwickelte sog. CEA (Chemisch-Enzymatischer Aufschluss).


Ergebnisse und Diskussion

Saccharomyces cerevisiae ist erfolgreich manipuliert worden (LEAF et al., 1996, POIRIER et al., 2001). Sie ist auch von uns genotypisch modifiziert worden. Es ist gelungen, die drei erforderlichen Gene von Ralstonia eutropha bzw. Methylobacterium extorquens einzeln in dieser Hefe zu etablieren. Eine PHB-Bildung, wenn auch in einem ökonomisch noch nicht relevanten Maße, konnte bei der rekombinanten Hefe, die das bakterielle phb-Synthasegen trägt, festgestellt werden. Um die Konzentration gebildeten Polymers wie auch dessen Synthesegeschwindigkeit zu erhöhen, war es notwendig, die drei phbB-Synthesegene als Kassette gemeinsam zu exprimieren. Diese wurden unter Nutzung des Vektors pESC-Leu, der die Gene in den Kassetten GAL1-Promotor-phbA-(bzw. phbB-) Gen-CYC-Terminator enthält, konstruiert und zusammen mit dem das phbC-Gen tragenden Vektor pYES2 in die Hefe transformiert. Die entstehenden Transformanten wurden hinsichtlich der Enzymaktivitäten der für die PHB-Bildung relevanten Enzyme und mittels Northern-Blot-Analyse charakterisiert und zu Untersuchungen der Produktbildung eingesetzt. Durch die Isolation des rekombinanten Proteins zusätzlich zu der in Saccharomyces vorhandenen NADPH:Acetoacetyl-CoA Reduktase konnte ein weiterer Beweis für die Ex-pression des phbB-Gens aus R. eutropha in S. cerevisiae Cl3ABYS86 geliefert werden.
Es ist auch gelungen, die genetische Information zur Synthese von PHB in Spezies der Gattungen Arxu-la und Debaryomyces zu transformieren und aktiv zu exprimieren. Zur Transformation in Arxula wurde eine Kassette im Vektor pAL-HPH1, welche aus dem TEF1-Promotor aus A. adeninivorans (Translokati-onselongationsfaktor EF-1??dem HPH Gen von E. coli, (Hygromycin B Resistenz) und dem PHO5-Gen von S. cerevisiae (Transkriptions-Terminations-Region) besteht, ausgewählt. Die Expression des Gens für die Reduktase konnte durch Messung der entsprechenden Enzymaktivität und die Northern-Blot-Analyse nachgewiesen werden. Zur Expression der phb-Gene in Debaryomyces wurde ein neues Wirts-Vektor-System unter Nutzung des Vektors pAL-HPH1 etabliert. Von den konstruierten Transformanten von D. polymorphus und D. hansenii wurden die Hygromycin B-Resistenz ermittelt sowie der Integrati-onsort des Plasmides pAL-HPH1 in der chromosomalen DNA und die mitotische Stabilität des Plasmides in den Transformanten bestimmt. Anschließend wurden die phb-Gene in D. hansenii und D. poly-morphus transformiert. In allen Transformanten konnte die Expression der Gene durch Messung der entsprechenden Enzymaktivitäten und Northern-Blot-Analyse belegt werden. Auch die Debaryomyces-Transformanten erwiesen sich als zur Biopolyester-Synthese fähig.
Die Parameter, die maßgeblich die Ökonomie bestimmen - Ertragskoeffizient, Geschwindigkeit, Gehalt in der Zelle/Biomasse - sind in allen transgenen Hefen noch unbefriedigend. Die Transformanten kön-nen mit den bakteriellen Wildtypen (noch) nicht konkurrieren. Die Gründe sind noch unklar. PHB wird von Wildtypen (vermehrt) gebildet, wenn Wachstum und Vermehrung limitiert sind (s. o.). Der Stoffwechsel ist weniger komplex und auf die Synthese weniger Produkte eingeschränkt. Je fokussierter der Stoffwechsel ist, um so mehr nähert sich der Ertragskoeffizient dem Stoffwechsel bedingt möglichen. Bei Organismen, die durch genotypische Maßnahmen zur Bildung fremder Produkte befähigt wurden, ist der Kohlenstofffluss so nicht kanalisiert. Sofern das nicht autogen geschieht, sind geringere Ausbeuten programmiert. Für die hier vorgestellten Transformanten dürfte dies zutreffen. Mit Blick auf Produktivität und Ökonomie eines Verfahrens lässt sich sagen, dass (intrazelluläre PHB-)Konzentration und spezifische Synthese-Geschwindigkeit stärker Einfluss nehmen als der Wirkungsgrad. Bekannt geworden sind bisher Konzentrationen um 0,5 % i.Tr., die von uns erreichten ca. 7 % sind ca. 10fach höher, aber nur 1/10 dessen, was mit Bakterien möglich ist.
Die gewählten Hefen dürften zu ähnlichen Produktbildungsraten in der Lage sein, wie die bekannten bakteriellen PHB-Produzenten. Theoretische Betrachtungen, die auf quantitativen Parametern für Wachstum und overflow metabolism basieren, stützen diese Aussage. Die spezifischen Aktivitäten der drei Enzyme sind sehr hoch, gemessen an den Aktivitäten, die theoretisch nötig sind, um bestimmte, ökonomisch in-teressante Geschwindigkeiten zu realisieren. Sie versprechen mehr, als wirklich erreicht worden ist. Dass die experimentell gefundenen Vermehrungsgeschwindigkeiten und Ertragskoeffizienten deutlich kleiner sind, als die häufig publizierten, die zur Berechnung herangezogen worden sind, ist sicher der Tatsache geschuldet, dass die Bedingungen nicht auf die jeweilige Spezies zugeschnitten worden sind. Wie effizient und mit welcher Geschwindigkeit Debaryomyces sp. und Arxula sp. zu wachsen vermögen, konnte noch nicht geklärt werden. Weitere Arbeiten zur geno- wie phänotypischen Optimierung sind er-forderlich. Zu klären ist, u.a. wie wichtig und unverzichtbar Phasine sind, oder allgemeiner, welche Rolle Kompartmentierung spielt, ob die Kunstprodukte (transgene Produzenten) auch mit der Fähigkeit zur Mobilisierung von PHB ausgestattet werden müssen und wie langzeit-stabil sie sind, und außerdem, ob und durch welche (phänotypischen) Maßnahmen die Parameter, die die Ökonomie bestimmen, verbessert werden können, will auch heißen, ob der Stofffluss auf das eigentliche target fokussierter geführt werden kann. Anhand der bisher erzielten Erkenntnisse kann der Flaschenhals noch nicht lokalisiert werden.
Intrazelluläre Produkte zu gewinnen, setzt Aufschluss der Produzenten voraus. Eine für Bakterien entwickelte Methode zur Desintegration bzw. zum Aufschluss der Zellen und zur Gewinnung von PHA wurde für die Spezies der Gattungen Saccharomyces, Arxula und Debaryomyces getestet. Es konnte gezeigt werden, dass dieses Prinzip auch für Hefen geeignet ist. Diese Methode, die pH-abhängige Reaktionen und enzymatisch katalysierte Hydrolyse kombiniert und nicht auf Extraktion mit organischen Lösungsmitteln setzt, funktioniert; sie muss jedoch noch auf Hefen angepasst und für sie optimiert werden.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

BREUER, U., FÖLLNER, C.G., KUNZE, G., BABEL, W. (2000): PHA production with a genetically modi-fied yeast - an alternative to the procaryotes? Frühjahrstagung der VAAM, München, Germany, 12.-16.03.2000. Biospektrum/Sonderheft: 95
BREUER, U., KUNZE, G., BABEL, W. (2000): Biopolymer production with transgenic yeasts? 8th Interna-tional Symposium on Biological Polyesters, Boston, USA, 11.-15.09.2000
KUNZE, G., BABEL, W., TERENTIEV, Y., WARTMANN, T., BREUER, U., HUTARDO-PICO, A., BERG-MANN, H. (2000): Wirts-Vektor-System für die heterologe Genexpression in der Hefe Debaryomyces. DE-Patent 100 60 133.2
TERENTIEV, Y., BÖER, E., BREUER, U., BABEL, W., KUNZE, G. (2001): Recombinant yeasts as hosts for the production of poly-3-hydroxybutyrate. 21st ISSY 2001, Lviv, Ukraine, 21.-25.08.2001
TERENTIEV, Y., BÖER, E., BREUER, U., BABEL, W., KUNZE, G. (2001): Recombinant yeasts as hosts for the production of poly-3-hydroxybutyrate. Mycologie-Tagung, Jena, Germany, 01.-03.10.2001
BREUER, U., BABEL, W., TERENTIEV, Y., KUNZE, G. (2002): Saccharomyces cerevisiae as a model system showing the capability of yeasts for a PHA production. Workshop Biopolymers: Limits of Natural Performances & Prospects for Overcoming, Leipzig, 30.-31.5.2002
BREUER, U., TERENTIEV, Y., KUNZE, G., BABEL, W. (2002): Yeast as producers of polyhydroxyalka-noates: Genetic engineering of Saccharomyces cerevisiae. Macromol. Biosci., 2, 380-386.
TERENTIEV, Y., BREUER, U., BABEL, W., KUNZE, G. (2002): Non-conventional yeasts as hosts for the production of polyhydroxybutyrate. Workshop Biopolymers: Limits of Natural Performances & Prospects for Overcoming, Leipzig, 30.-31.5.2002.
TERENTIEV, Y., BREUER, U.; BÖER, E.; BABEL, W., KUNZE, G. (2002): Production of polyhydroxybutyrate by non-conventional yeasts. In: ISBP 2002 International Symposium on Biological Polyesters, Münster, 22.-26.09.2002, SL15, Abstractband: 71


Fazit

Die in dem Projekt erzielten Ergebnisse zeigen, dass es durch gentechnische Modifikation gelingt, nicht nur Saccharomyces cerevisiae, sondern auch Hefen der Gattungen Arxula und Debaryomyces zur PHA-Produktion zu befähigen. Die Etablierung der genetischen Information zur Synthese des gewünschten Produktes und aktive Expression der in die Synthesesequenz unmittelbar eingeschlossenen Enzyme sind notwendige Voraussetzungen, offenbar aber nicht hinreichend. Hinsichtlich einer ökonomischen Herstellung des Polymers sind weitere Manipulationen notwendig. Um sie gezielt durchzuführen zu können, sind Kenntnisse über Flaschenhälse erforderlich.
Weitere Untersuchungen - physiologisch-biochemischer und technologischer Art - sind notwendig, um Hefen als Produktionssysteme für PHA zu qualifizieren. Gemessen am internationalen Stand sind die Ergebnisse herausragend, an der ökonomischen Zielstellung nicht befriedigend. In der Regel ist mehr Potential und Zeit nötig, um ein technologisch und ökonomisch relevantes, d. h. anspruchsvolles Ergeb-nis zu erzielen. Die Arbeiten werden auch über das Projekt hinaus weiter verfolgt werden.