Projekt 13040/15

Förderschwerpunkt Biotechnologie: Verbund Industrielle Nutzung von Biokatalysatoren: Entwicklung innovativer Mikroreaktoren zur frühen Identifizierung industriell relevanter Enzymreaktionen am Beispiel der Esterase

Projektträger

Universität des SaarlandesLehrstuhl für Technische Biochemie
Campus A 1.5
66123 Saarbrücken
Telefon: 0681/3022905

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Durch moderne Methoden der Molekularbiologie kann in kurzer Zeit eine Vielzahl von Variationen von Enzymen erzeugt werden, von deren gezieltem Einsatz man höhere Wertschöpfungen bei reduzierter Umweltbelastung erwartet. In diesem Projekt wurden Systeme etabliert, die es gestatten, biokatalytische Reaktionen mit Umsetzung von Sauerstoff und/oder Säure in großer Zahl zu quantifizieren. Dazu wurden Mikrotiterplatten mit integrierter optischer Sensorik entwickelt und mit pH-Regelung sowie einer angepassten Screening-Methodik eingesetzt. Eine Esterase wurde rationell und evolutiv optimiert. Diese wurde mittels eines Autotransporter-Systems in E. coli an der Oberfläche der Zellen exprimert. Das Screening dieser Zellen wird mittels der pH-Sensorplatten durchgeführt.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenIn einem Projektteil wurden Mikrotiterplatten mit integrierten Optosensoren für Sauerstoff und pH (Messung von Fluoreszenzabschwächung und -abklingzeit) entwickelt. Durch intrinsische Referenzierung sind die Platten kalibrationsarm. Die entwickelten Sensoren wurden charakterisiert anhand der Ansprechzeit, der Reproduzierbarkeit und der Querempfindlichkeit. Die Durchmischung in Mikrotiterplatten wurde durch Analyse von pH-Antworten auf Pulse von Alkali charakterisiert. Enzymatische Reaktionen wurden mittels der immobilisierten Sensoren anhand der pH- oder Sauerstoffänderung beobachtet. Zur Bestimmung kinetischer Parameter wurden geeignete Auswertemethoden unter Einsatz mathematischer Modelle erarbeitet, die für das industrielle Screening geeignet sind. Die Esterase EstA von B.gladioli und eine künstlich erzeugte Esterase EsjA wurden evolutiv variiert zum Einsatz als technischer Biokatalysator. Es geht dabei vornehmlich um die Racematspaltung von Estern. Ein Autotransporter-System in E.coli wurde für die Sekretion von Varianten dieser Esterase genutzt. In Verbindung mit den integrierten Platten und den Screening-Methoden ist eine neue Methode unter Verwendung ganzer Zellen zur schnellen Erzeugung und Testung der katalytischen Aktivität von Enzymen etabliert worden.


Ergebnisse und Diskussion

In diesem Projekt wurden neue Screening-Methoden zur Entwicklung von Enzymen entwickelt. Im Fokus standen dabei vor allem Esterasen, aber auch Sauerstoff verbrauchende Enzyme wie Oxidasen. Einer-seits wurden neue Methoden zur Herstellung von Enzymbibliotheken mit Hilfe des so genannten Surfa-ce-Displays entwickelt. Andererseits wurden neue Screening-Methoden unter Zuhilfenahme von in die-sem Projekt entwickelten Mikrotiterplatten erarbeitet und getestet. Im Projekt wurden 3 Typen von Mikro-titerplatten entwickelt, die inzwischen von der Firma Presens GmbH auf dem Markt angeboten werden. Dazu mussten neue Sensorcocktails und Beschichtungstechniken entwickelt werden. Diese Platten enthalten Sensoren, bei denen jeweils ein geeignetes Referenzfluorophor mit immobilisiert ist. Durch diese Referenzierung ist die Kalibration wesentlich erleichtert. Beim Plattentyp HP96T ist die pH-Messung im Bereich 5-8 mit einer kurzen Ansprechzeit von wenigen Sekunden möglich. Interferenzen durch Fluo-rophore im Medium sind bei der optisch isolierten pH-Platte HP96L ausgeschaltet. Da für diese Platte eine etwas dickere Sensorschicht benötigt wurde, ist die Ansprechzeit leicht verlängert. Eingehende Mischungsstudien mit den pH-Platten zeigten, dass die ursprünglich vorgesehene Entwicklung einer pH-Stat-Methode, bei der mit Hilfe einer Nanoliter-Pumpe der pH-Wert in den Mikrotiterplatten geregelt werden sollte, in verfügbaren Readern nicht realisiert werden kann. Mit der entwickelten pH-Dyn-Methode, bei der durch Einsatz eines geeigneten Puffersystems messbare pH-Änderungen erhalten werden, kann jedoch die Aktivität von Enzymen, bei deren Einsatz Säuren produziert oder verbraucht werden, hinreichend genau bestimmt werden. Der Sauerstofftransfer in Mikrotiterplatten unter verschiedenen Bedingungen wurde mit den Sauerstoffplatten OP96F eingehend studiert. Darauf aufbauend wurde eine Screening-Methode für Oxidasen entwickelt und beispielhaft eingesetzt. Die Esterase A von Burgholderia gladioli wurde mittels Autodisplay an der Oberfläche von E. coli exprimiert. Die Esterase-Aktivität ganzer Zellen, die EstA an der Oberfläche exprimierten, war mit unterschiedlichen Methoden, einschließlich der Messung in Sensor-Mikrotiterplatten nachweisbar. Durch rationales Design wurde eine neue Esterase, EsjA, konstruiert und mit Autodisplay an die Zelloberfläche von E. coli gebracht. Durch die so erhaltene, stark gesteigerte Enzymaktivität war es möglich, die Esterase-Aktivität ganzer Zellen innerhalb weniger Minuten in Sensor-Mikrotiterplatten (MTP) zu messen, womit eine wichtige Voraussetzung zum Screening von Bibliotheken erfüllt war. Es wurden zwei Zufallsbibliotheken von EsjA durch Error-Prone PCR erzeugt und an der Oberfläche von E. coli exprimiert.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Publikationen.
J. Mol. Catal. B: Enz. (2002), Biotechnol. Bioeng. (2001, 2003, Biotechnol. Prog. (2002), Appl. Microbiol. Biotechnol. (2003), transkript (2003), bioforum (2001), biospektrum (2001), J.Dairy Res. (2003), Adv. Biochem.Eng.Biotechnol. (2002), 2 in Ausarbeitung
Vorträge und Poster. 2001:
2ndSymp.Appl.Shaking, N.Y. (1V), Biotrans, Darmstadt (2P), ECB10, Madrid (1P). Jahrestag.Biotechnol., Leipzig (1V), Biotechnica 2001 2002: Adv. course biocatalysis, März (1V); Biocatalysis 2002, Hamburg (1V+4P); Advanced course on biocatalysis, März 2002 (1V); Inst. Bio-chemie der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster, 4.07 (1V); GDCH-Abendvortrag, Institut für Chemie und Biochemie, Ernst-Moritz-Arndt-University Greifswald, 8.10. (1V); Fourth Europ.Grad.Student Meeting, Feb., Frankfurt/Main (1 P); Gemeinsame Jahrestag. der GDCH, FG Medizin. Chemie, DPhG, FG Pharmazeutische Chemie, Travemünde (1 P); ESBES4, Delft (1V) 2003: Jahrestag. Biotechnol. 2003 (1V+2P), Biocat 2003, Barcelona (1V), Biotechnica 2003 (1P), Univ. Münster (1V), Univ. Greifswald (1V), FH Lausitz (1V), Univ. Düsseldorf (1V), Univ. Darmstadt (1V).


Fazit

Mit den drei neuen in diesem Projekt entwickelten Mikrotiterplatten mit integrierten Sensoren für pH und Sauerstoff können Enzymkinetiken bestimmt werden. Diese sind in konventionellen Fluoreszenzreadern direkt einsetzbar und benötigen nur einen minimalen Aufwand für die Kalibrierung. Mit diesen Platten konnten umfangreiche Studien zum Mischen und Sauerstofftransport in Mikrotiterplatten durchgeführt werden. Die Platten sind nun kommerziell erhältlich und können auch zum Züchten von Zellen verschie-denster Art eingesetzt werden. Enzyme können mit einem neuen Autotransportersystem in E. coli exprimiert, an die Oberfläche sekretiert und dort aktiv präsentiert werden. Mit diesen Zellen wurden nach mo-lekularer Evolution erste Screening-Tests mit den pH-Platten durchgeführt. Mit dem Projektabschluss stehen nun neue Werkzeuge für eine effiziente Entwicklung neuer Biokatalysatoren mit entsprechend positiven ökonomischen und ökologischen Auswirkungen zur Verfügung.