Projekt 13028/23

Förderschwerpunkt Biotechnologie: Verbund Sensorik in der Biotechnologie: Entwicklung eines Verfahrens zur Produktion einer bakteriellen Phytase

Projektträger

Universität BielefeldTechnische FakultätLehrstuhl für Fermentationstechnik
Universitätsstr. 25
33501 Bielefeld
Telefon: 0521/106-5301

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Ein Verfahren zur Produktion des Enzyms Phytase für den Einsatz im Lebensmittelbereich soll auf Basis optimierter Hochleistungskultivierungen von Bakterien entwickelt werden. Das Enzym spaltet Phytinsäure, wodurch die Nutzung sowohl des Phosphat- als auch Zuckeranteils von Nährstoffen und Futtermitteln verbessert wird. Im Sinne eines produktionsintegrierten Umweltschutzes führt dies zur Schonung energetischer und stofflicher Ressourcen. Dabei werden in einer Kooperation zwischen Universität und einer mittelständischen Firma technische Neuerungen erarbeitet, die sich durch deutliche Umweltentlastungseffekte auszeichnen und sich vom derzeitigen Stand der Produktionsverfahren deutlich unterscheiden.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDas Projekt umfasst die Konstruktion eines optimierten Produktionsstamms für eine bakterielle Phytase, die in der Gruppe von Dr. Greiner an der Bundesforschungsanstalt für Ernährung in Karlsruhe erstmalig isoliert wurde. Erhebliche umweltrelevante Verbesserungen sollen dadurch erreicht werden, indem diese Phytase während ihrer Produktion ins Medium ausgeschleust wird. Dadurch können höhere Produktivitäten erzielt (Ressourcen- & Energieeinsparung) und die Reinigung des Enzyms kann erheblich umweltschonender durchgeführt werden, als dies in den bisher üblichen Prozessen möglich ist. Ein Hauptteil der Arbeit besteht in der Entwicklung eines effektiven Produktionsprozesses. Dazu sollen Hochzelldichteverfahren entwickelt werden. Derartige Verfahren erlauben eine bessere Auslastung der Produktionsanlagen, was eine Senkung der umweltverbrauchenden Investitionskosten mit sich bringt. Durch den Einsatz von Biosensoren sowie moderner Mess-, Steuer- und Regeltechnik - z. T. auch in Zusammenarbeit mit Prof. Scheper vom TCI der Universität Hannover - sollen diese Hochleistungsverfahren so optimiert werden, dass signifikante Einsparungen von Rohstoffen und Energie im Vergleich zu etablierten Prozessen erzielt werden. Angewandte Gentechnik und moderne MSR-Technik bzw. Biosensorik bilden deshalb den Kern der im Rahmen dieses Projekts eingesetzten Methodenvielfalt.


Ergebnisse und Diskussion

Im ersten Jahr der Projektlaufzeit wurden die Voraussetzungen für die Entwicklung des neuartigen biotechnologischen Verfahrens zur Phytaseproduktion erarbeitet. An der Universität Bielefeld wurden die folgenden Ergebnisse erzielt. Das Phytasegen wurde mittels PCR aus dem ursprünglichen zur Erstklonierung verwendeten Plasmid amplifiziert und in Vektoren hoher Kopienzahl hinter verschiedene Promotoren kloniert. Für die Entwicklung eines ökonomischen und ressourcensparenden Produktionsverfah-rens ist es notwendig, dass die Phytase nach Überexpression in das Kulturmedium sekretiert wird. Um zu untersuchen, ob - ähnlich wie andere bereits erfolgreich untersuchte Proteine - die Phytase sekretiert wird, sind zwei Varianten verfolgt worden: 1. Stabile Integration der Kassette ins Bakterienchromosom und Lokalisierung des Phytasegens auf einem Multi-copy-Plasmid und 2. Lokalisierung der Kassette auf dem Multi-copy-Plasmid, welches das Phytasegen enthält. Für die Integration der Kassette ins Chromosom wurde ein genetisches Verfahren entwickelt, bei dem die Kassette spezifisch in das lacZ-Gen von E. coli integriert wurde. Der Vergleich der beiden o. g. Varianten hinsichtlich der Expression und Sekretion zeigte, dass bei einem Einbau der Kassette in das Expressionsplasmid die Sekretion ins Medium wesentlich höher war als bei Integration der Kassette ins Chromosom. Die Sekretion der Phytase ins Medium führte zu einer etwa 6-fachen Steigerung der Gesamtexpression der Phytase, wobei der Anteil des produzierten Enzyms im Medium in Abhängigkeit vom Promotor und der Zusammensetzung des Mediums 70-95% betrug.
Bei Untersuchungen zum Einfluss des Bakterienstamms auf die Expression und Sekretion erwies sich der Stamm BL21(DE3) als deutlich produktiver als andere Stämme (TG1, JM109, N4830, E2638). Deshalb wurde dieser Stamm für die weitere Entwicklung des Projekts ausgewählt. Die mit Abstand höchste Expression wurde mit dem Tac- und Bgl-Promotor erzielt. Da der Tac-Promotor gegenüber dem Bgl-Promotor mit zwei wesentlichen Nachteilen behaftet ist (Induktion mit teurem IPTG und Sekretion nur in Komplexmedien) wurde der Bgl-Promotor für die Expression der Phytase verwendet. Das Bakterienwachstum sowie die Expression und Sekretion wurden zunächst in Schüttelkolbenversuchen in Abhängigkeit von der Kulturdauer untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Phytaseexpression erst in der späten exponentiellen Wachstumsphase der Bakterien mit bzw. durch den Beginn der Sekretion stimuliert wurde. Der überwiegende Teil der gebildeten Phytase konnte im Kulturmedium nachgewiesen werden. Das Bakterienwachstum wurde durch die Bildung der Phytase nicht verzögert. Von der ASA Spezialenzyme GmbH wurden Vorversuche zur Übertragung des Prozesses in den industriellen Maßstab durchgeführt sowie Marktuntersuchungen vorgenommen. Die Einsatzbereiche für das Enzym Phytase sind die Schweine-, Geflügel- und Fischzucht sowie die Lebensmittelproduktion. Im Bereich der Le-bensmittelproduktion ist die Entwicklung der Akzeptanz der Verbraucher in Europa für Lebensmittel, die unter Verwendung gentechnisch veränderter Hilfsstoffe produziert werden, ebenfalls nur sehr schwer kalkulierbar. Für die Abschätzung eines Marktpotenzials wurden daher vorerst nur die Daten für die Schweine- und Geflügelzucht verwendet. In Deutschland ergibt sich ein Futtermittelverbrauch von ca. 20 Mio. t Schweinefutter pro Jahr, in Europa von ca. 135 Mio. t. Für die Geflügelzucht ergeben sich Werte von 3,2 bzw. 21 Mio. t pro Jahr. Bei einer Einsatzmenge von 500 U Phytase pro kg Futter und einer Akti-vität von 2 Mill. U pro Liter Phytase ergibt sich ein maximales theoretisches Marktpotenzial für Phytase in Deutschland von 5,8 x 106 Liter und in Europa von 39 x 106 Liter. Erste Versuche zur Entwicklung des Aufarbeitungsverfahrens ergaben, dass auf ein Aufschlussverfahren verzichtet werden kann, da das Enzym Phytase nahezu vollständig in das Medium ausgeschieden wird. Versuche zur Ultrafiltration zeigten, dass die Phytase im Kulturüberstand aufkonzentriert werden kann.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

1.) Miksch, G., Kleist, S. & Flaschel, E. (2000): Fermentative production of a bacterial Phytase. Vortrag auf der Int. Tag. Biotechnology, Berlin.
2.) Miksch, G., Kleist, S. & Flaschel, E. (2000): Nutzung biotechnologischer Methoden für die Entwicklung von Verfahren zur Produktion einer E. coli-Phytase. Vortrag auf der TerraTec, Leipzig.
3.) Igbasan et al. (2000): Comparative studies on the in vitro properties of phytases from various microbial origins. Archives of Animal Nutrition, 53: 353-373.
4.) Igbasan, F.A., Simon, O., Miksch, G., Männer, K. (2001): The effectiveness of an Escherichia coli phytase in improving phosphorus and calcium bioavailabilities in poultry and young pigs. Archives of Animal Nutrition, 54: 117-126.
5.) Miksch, G. & Flaschel, E. (2001): Secretion of homologous and heterologous recombinant proteins in Escherichia coli and other Gramnegative bacteria by using a new secretion system. In: Recombinant Protein Production with Prokaryotic and Eukaryotic Cells. 6.) Miksch, G., Kleist, S., Friehs, K., Flaschel, E. & Cordes, A. (2001): Biotechnologische Produktion der E. coli-Phytase. In: Erb, R. & Heiden, S. (Hrsg.) (2001): Sensorik, Sonderausgabe BIOSpektrum: 60-62.


Fazit

Die im Projekt erzielten Ergebnisse zeigen, dass die Überexpression der bakteriellen Phytase in E. coli möglich ist. Die in E. coli produzierte Phytase kann durch die Nutzung des entwickelten Sekretionssystems in das Kulturmedium sekretiert werden. Damit bestehen die Voraussetzungen für die Entwicklung eines Verfahrens zur extrazellulären Produktion der Phytase. Für die Prozessführung, vor allem im Zulauf-Verfahren, ist die Einbeziehung der Sensortechnik notwendig. Erste Fermentationsversuche zeigen, dass eine extrazelluläre Produktion der bakteriellen Phytase auch im Fermentermaßstab möglich ist.