Projekt 13028/19

Förderschwerpunkt Biotechnologie: Verbund Sensorik in der Biotechnologie: Cancerogenitätstest für neue Materialien auf Basis der Telomeraseaktivität mittels faseroptischen Sensors

Projektträger

Fraunhofer-Institut für Biomedizinische Technik (IBMT)Arbeitsgruppe Molekulare Bioanalytik & Bioelektronik
Ensheimer Str. 48
66386 St. Ingbert
Telefon: 0331/58187 - 200

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Das Projekt umfasst die Entwicklung und den Einsatz eines Detektionsverfahrens für die Telomeraseaktivität, die Kanzerogenität von Substanzen anzeigen kann. Ziel des Vorhabens war es, ein Testverfahren zu entwickeln, das die Stoffwirkung auf Mensch und Umwelt spezifischer anzeigen kann als derzeit gängige Mutagenitätstests. Es sollen damit Materialien in ihrer Entwicklungsphase bewertet werden können, um so in einem frühen Stadium der Produktentwicklung zukünftige Umweltbelastungen und Gesundheitsgefährdungen zu vermeiden. Ökologisch betrachtet wäre dies ein wichtiger Schritt in Richtung umweltverträglicher Produktentwicklung. Hierbei könnten in hohem Maße Ressourcen und Kosten schon in der Entwicklungsphase eingespart werden. Der neue Bioassay würde damit auch zur Reduzierung von Tierversuchen beitragen.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenZur Durchführung des Vorhabens werden faseroptische Biosensortechnologie mit einem geeigneten Zellkultursystem kombiniert. Da die Telomerase selbst eine Polymerase ist, wird erwartet, dass ihre Aktivität auch ohne einen Amplifikationsschritt durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) nachgewiesen werden kann. Als erster Schritt wurde mit einer Reversen Transkriptase als Modell der Nachweis von Polymeraseaktivität an RNA-Templaten auf dem Biosensor geführt. Dieser Schritt war erforderlich, da die Telomerase ebenso als Reverse Transkriptase aufgefasst wird, die allerdings ihr Template im Ribonukleinkomplex mit sich führt (Familie der TERT Enzyme), aber nicht in isolierter Form zur Verfügung steht.
Der zweite Schritt bestand daher im Nachweis der Telomeraseaktivität im Zellextrakt mittels Biosensortechnologie. Faseroptische Fluoreszenzsensorik wurde zur Erhöhung der Sensitivität eingeführt.
Der dritte Schritt war die Anwendung des Messverfahrens auf Zellkulturen, die eine erhöhte Telomeraseaktivität haben, sowie dem Nachweis der Spezifität der Aktivität in bekannten, kontrollierten Systemen. Im vierten Schritt sollten die Bedingungen der Kulturführung für eine konstante Telomeraseaktivität etabliert werden. Im fünften Schritt sollte das Zellkultursystem in der Kombination mit dem Sensor auf Modellsubstanzen angewandt werden und die Korrelation der gezielten Noxen mit den Konzentrationen ermittelt werden.


Ergebnisse und Diskussion

Zur Durchführung des Vorhabens werden faseroptische Biosensortechnologie mit einem geeigneten Zellkultursystem kombiniert. Da die Telomerase selbst eine Polymerase ist, wird erwartet, dass ihre Aktivität auch ohne einen Amplifikationsschritt durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) nachgewiesen werden kann. Als erster Schritt wurde mit einer Reversen Transkriptase als Modell der Nachweis von Polymeraseaktivität an RNA-Templaten auf dem Biosensor geführt. Dieser Schritt war erforderlich, da die Telomerase ebenso als Reverse Transkriptase aufgefasst wird, die allerdings ihr Template im Ribonukleinkomplex mit sich führt (Familie der TERT Enzyme), aber nicht in isolierter Form zur Verfügung steht. Der zweite Schritt bestand daher im Nachweis der Telomeraseaktivität im Zellextrakt mittels Biosensortechnologie. Faseroptische Fluoreszenzsensorik wurde zur Erhöhung der Sensitivität eingeführt.
Der dritte Schritt war die Anwendung des Messverfahrens auf Zellkulturen, die eine erhöhte Telomeraseaktivität haben, sowie dem Nachweis der Spezifität der Aktivität in bekannten, kontrollierten Systemen. Im vierten Schritt sollten die Bedingungen der Kulturführung für eine konstante Telomeraseaktivität etabliert werden. Im fünften Schritt sollte das Zellkultursystem in der Kombination mit dem Sensor auf Modellsubstanzen angewandt werden und die Korrelation der gezielten Noxen mit den Konzentrationen ermittelt werden.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

· P. M. Schmidt, F. Kleinjung, F. W. Scheller, F. F. Bier (2000): Kinetic Characterization of Reverse Transcriptase on Nucleic Acid Modified Surfaces, 6th World Congress on Biosensors, San Diego, USA, Book of Abstracts p.226.
· F. F. Bier, P. M. Schmidt (2000): Optische Sensorik für die Aktivität von DNA-modifizierenden Enzymen, Task Force Workshop Faseroptische Sensoren, 4.9.2000, Potsdam.
· F. F. Bier, P. M. Schmidt (2001): Sensoric Approach to the Determination of Cancerogenity by Measurement of Telomerase Activity, Task Force Toxicity Sensors, 5.2.2001, Hannover.· P. M. Schmidt, F. W. Scheller, F. F. Bier (2001): Telomeraseaktivität auf nukleinsäuremodifizierten Sensoroberflächen, 2. deutsches BioSensor Symposium, Tübingen.
· P. M. Schmidt, E. Matthes, F. W. Scheller, F. F. Bier (2001): Nachweis der Telomeraseaktivität in Zellkulturen mittels eines faseroptischen Sensors. In: Erb, R. & Heiden, S. (Hrsg.) (2001): Sensorik, Sonderausgabe BIOSpektrum: 47-51.
· P. M. Schmidt, E. Matthes, F. W. Scheller, M. Bienert, C. Lehmann, A. Ehrlich, F. F. Bier (2002): Realtime determination of telomerase activity in cell extracts using an optical biosensor. Biol. Chem. 383: 1659-1666.
· P. M. Schmidt, C. Lehmann, E. Matthes, F. F. Bier (2002): Detection of activity of telomerase in tumor cells using fiber optical biosensors. Biosensors & Bioelectronics 17: 1081-1087


Fazit

Die grundsätzlichen Voraussetzungen für die Entwicklung eines Cancerogenitätsassays auf Basis von Biosensorik mittels Messung der Telomerasetätigkeit konnten erfolgreich gezeigt werden. Die Telomeraseaktivität auf der Oberfläche wurde an immobilisierten spezifischen Primern nachgewiesen. Zielgerecht konnte dabei auf einen Amplifizierungsschritt wie der PCR verzichtet werden. Ein wesentliches Ergebnis für die weitere Entwicklung stellt die Hybridisierung der neu synthetisierten Telomere mit einem FITC-gelabelten Oligomer dar. Es wurde eine Methode gefunden, mit der die störenden Einflüsse der Sekundärstrukturen der Telomere beseitigt worden sind. Damit wurde die untere Nachweisgrenze auf nur noch 50.000 Zellen verringert. Es wurde auch eine weitere Zelllinie (NIH 3T3) verwendet, die keine oder nur eine sehr geringfügige Telomeraseaktivität aufweist. Bei diesen Zellen wurde die Induktion durch ein bekanntes Cancerogen anhand des Anstiegs der Telomeraseaktivität nachgewiesen. Die Entwicklung des Assays verlief erfolgreich und eine kommerzielle Umsetzung des Assays durch den beteiligten Industriepartner soll im weiteren Verlauf angestrebt werden. Neben dem potenziellen Einsatz des Assays in der pharmazeutischen, kosmetischen und chemischen Industrie, wo u. a. auch Tierversuche vermindert werden könnten, sollte auch der medizinische Aspekt nicht vernachlässigt werden, da dieser Ansatz das Potenzial besitzt, als schneller, zuverlässiger Assay für den Nachweis transformierter Zellen weiterentwickelt zu werden. Für diesen Einsatzbereich wird jetzt ein Industriepartner gesucht.