Projekt 11983/01

Einsatz der Kapillarelektrophorese zum Nachweis von DNA-Schäden durch Umweltschadstoffe

Projektträger

Ludwig-Maximilians-Universität MünchenWalther-Straub-InstitutAbteilungToxikologie
Nussbaumstr. 26
80336 München
Telefon: 089/2180-73-802

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Im komplexen Geschehen der chemischen Kanzerogenese stellt die Bindung der Fremdstoffe an die DNA den ersten entscheidenden Schritt dar. Welchen Anteil die Belastung mit Kanzerogenen, besonders solchen aus der Umwelt, an den Krebserkrankungen des Menschen hat, ist nach wie vor umstritten und kann weder durch epidemiologische Untersuchungen noch durch generelles Umweltmonitoring ausreichend geklärt werden. Das 32P-Postlabeling von DNA-Addukten ist das empfindlichste Verfahren für das Biomonitoring der menschlichen Belastung mit Kanzerogenen. Mit den bisher angewandten analytischen Trennmethoden, Dünnschichtchromatographie, DC, und Hochdruckflüssigkeitschromatographie, HPLC, gelingt die sichere Identifizierung von Belastungen mit Umweltchemikalien nicht befriedigend. In unserem Projekt soll deshalb als neue Trenntechnik die Kapillarelektrophorese erprobt werden.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie von uns entwickelte HPLC-Blotting-Methode für die Bestimmung von 32P-markierten DNA-Addukten soll auf die Bedingungen der Kapillarelektrophorese übertragen werden. Drei Schwerpunkte der Entwicklungsarbeit sind zu nennen. (1) Die Auftragung ausreichend hoher Flüssigkeitsmengen in die Kapillare, damit die gelabelten Proben (10-20 µl) verlustfrei chromatographiert werden können. Hierzu bestehen bereits eine Reihe von Verfahren, die auf unsere Addukte übertragen und optimiert werden müssen. (2) Die Erarbeitung von Trennbedingungen für die verschiedenen in der Umwelt zu erwartenden Addukte. Hier kommt uns unsere Erfahrung mit DNA-Addukten verschiedenster chemischer Natur und die Zu-sammenarbeit mit einer Reihe von Kollegen aus dem In- und Ausland zugute. (3) Die Technik für das Blotting des Eluats der Kapillare muß entwickelt werden. Wichtig ist bei der Kapillarelektrophorese die Aufrechterhaltung des Spannungsunterschieds zwischen Kapillareingang und Kapillarende. Sobald diese technischen und analytischen Probleme gelöst sind, werden wir daran gehen humane Proben auf DNA-Addukte zu untersuchen. Mit Hilfe der hohen Trennleistung der Kapillarelektrophorese sollte es gelingen eine Art Fingerprint zu bekommen. Unterschiede zwischen Gesunden und Tumorpatienten könnten dann Hinweise auf die Beteiligung von chemischen Kanzerogenen in der Krebsentwicklung geben.


Ergebnisse und Diskussion

Die in diesem Projekt entwickelte Blottingmethode mit der Kapillarzonenelektrophorese ermöglicht eine sehr selektive und sensitive Analyse von DNA-Addukten nach 32P-Postlabeling. Mehrere DNA-Adduktanalysen von Standardverbindungen und Leber- bzw. Herz-DNA von mit Schadstoffen behandelten Ratten belegen die Leistungsfähigkeit dieses Systems. Der Vorteil gegenüber der Dünnschichtchromatographie liegt in der höheren Reproduzierbarkeit der Meßergebnisse und der möglichen Mehrfachinjektion ei-ner Probe. Die langsameren Migrationsgeschwindigkeiten der Nukleotide im Vergleich zu denen der Nukleotidaddukte stellt einen weiteren Vorteil gegenüber HPLC-Techniken und der DC dar. Der vielfache Überschuß an adduktfreien Nukleotiden und die ungewünschten Anlagerungsprodukte von [g-32P]-ATP an Komponenten der Reaktionsmischung wirken sich deshalb nicht störend auf die Analyse der Addukte aus und machen Vorsäulenschaltungen (HPLC) und zeitintensive Waschschritte (DC) überflüssig. Die etwas schlechtere Sensitivität gegenüber der DC (ungefähr Faktor 10) hängt mit dem geringen Injektionsvolumen bei der CE (ca. 50 nl) zusammen. Durch Aufkonzentrierungsverfahren (electrostacking) könnte bis zu 1 µl Probe injiziert und die Nachweisgrenze deutlich verbessert werden. Wegen der hohen Salzkonzentration in der Probe und den schlechten Retardationseigenschaften an den stationären Phasen von Festphasenkartuschen konnte dieses Ziel bisher noch nicht erreicht werden. In Verbindung mit modernen Anreicherungsverfahren für Addukte wie z.B. die Immunaffinitätschromatographie sollte es jedoch gelingen, die notwendige
Nachweisempfindlichkeit zu erreichen.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Die in diesem Projekt erzielten Ergebnisse wurden als Poster (Nr. 113) auf einer internationalen Fachtagung für Kapillarelektrophorese vorgestellt und als Publikation der Analytical Chemistry vorgelegt:
Schmitz O.; Richter E.; Capillary Zone Electrophoresis with On-Line Blotting for Separation and Detection of 32P-Postlabeled DNA-Adducts. 12th International Symposium on High Performance Capillary Electrophoresis & Related Microscale Techniques, Palm Springs, CA, 23.-28. 01.1999
Schmitz O.; Richter E.; Capillary zone electrophoresis with on-line blotting for separation and detection of 32P?postlabeled DNA adducts, Anal. Chem., submitted


Fazit

Die von uns entwickelte Blottingmethode kombiniert die hohe Selektivität der Kapillarzonenelektrophorese mit der Sensitivität der TLC und stellt momentan nach der TLC die empfindlichste Analysenmethode zur Bestimmung von DNA-Addukten dar. Sollten weiterführende Arbeiten eine Probenanreicherung durch eine Art des Elektrostackings ermöglichen, könnte die Empfindlichkeit noch weiter verbessert werden. Desweiteren zeigt unsere Blottingmethode noch andere Vorteile auf, indem man beispielsweise DNA-Addukte mit einem Fluoreszenzmarker anstelle des [g-32P]-ATP labelt und die auf dem Filterpapier geblotteten Addukte mit einer CCD-Kamera bestrahlt und die resultierende Fluoreszenz über mehrere Minu-ten mißt. Dies könnte gegenüber herkömmlichen CE-Analysen mit einem Laser-induzierten-Fluoreszenzdetektor zu einer deutlichen Steigerung der Empfindlichkeit führen. Allerdings müßte zuerst ein Ersatz für das zum Blotten verwendete Filterpapier gefunden werden, da die Eigenfluoreszenz von Papier eine empfindliche Fluoreszenzmessung unmöglich macht.