Projekt 11661/01

Fluoreszenz- und Absorptionssensor zur spektroskopischen Bestimmung des biologischen Anteils von Belägen in wäßrigen Systemen

Projektträger

Universität Duisburg-EssenFachbereich ChemieAquatische Mikrobiologie
Geibelstr. 41
47057 Duisburg
Telefon: 0203-379-1936

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Entwicklung eines Sensorsystems zur Bestimmung des biologischen Anteils von Belägen in wäßrigen und feuchten technischen und ökologischen Systemen. Das Sensorsystem basiert auf der wellenlängen-spezifischen Fluoreszenz biologischer Moleküle mit und ohne Fluoreszenzsonden. Die Identifizierung und ggf. Quantifizierung der biologischen Anteile kann sowohl nach Probenahme als auch direkt im beobachteten System on-line und zerstörungsfrei erfolgen. Dieses Sensorsystem erlaubt die Art der Deposition zu differenzieren und die Gegenmaßnahmen zu optimieren. Damit läßt sich der Zeitpunkt und der Ort für ein Eingreifen gegen unerwünschte Beläge und Biofilme ermitteln sowie den Einsatz umweltbelastender Reiniger und Biozide verringern.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie Arbeit beginnt mit der Entwicklung eines für Fluoreszenzmessungen tauglichen Sensorkopfes, der die Anforderungen einer konventionellen Fluoreszenzküvette und eines on-line Meßfühlers gleichzeitig erfüllt. Anschließend wird das gesamte Meßsystem, bestehend aus Meßkopf, Einkoppeloptiken und dem spektrometrischen Teil, zusammengestellt. Als letztes wird die Steuer- und Auswertesoftware entwickelt und erprobt. Die obengenannten Arbeitsschritte werden in enger Zusammenarbeit mit dem In-dustriepartner und vorwiegend in seinen optischen und elektronischen Laboratorien durchgeführt.
Die Biofilmanzüchtung erfolgt in einem überwachten Bioreaktor und in geeigneten Biofilmdurchflußzellen beim Antragsteller. Die Untersuchungen erfolgen an drei Probenarten: Biofilmsuspensionen, intakter Biofilm auf Glascoupons und intakter Biofilm in der Durchflußzelle. In der ersten Phase der Untersuchungen werden die Biofilme mit bekannten Marker-Molekülen, in der Biologie verwendeten Fluoreszenzfarbstoffen, gefärbt und die Fluoreszenzintensität wird in Abhängigkeit vom Biofilmalter bzw. Biofilmdicke ausgewertet. Die ausgewählten Marker-Moleküle haben eine bekannte Wechselwirkung mit bestimmten biologischen Molekülen in den Zellen des Biofilms. In der zweiten Phase der Untersuchungen werden nicht markierte Biofilme mit dem Meßsystem untersucht und die angeregte Fluoreszenz relevanter biologischer Moleküle untersucht. Nach Identifizierung der erfaßten Fluoreszenzsignale wird ihre Intensität in Korrelation mit Biofilmparametern (Alter, Dicke, Gesamtzellzahl/Oberfläche) gebracht.


Ergebnisse und Diskussion

Im vorliegenden Projekt wurde ein Sensor zur Erfassung des biologischen Anteils bei der Entstehung von unerwünschten Belägen in Wassersystemen erarbeitet.

Zunächst wurden die Fluoreszenz- und Absorptionseigenschaften künstlich hergestellter Beläge im Transmissions- und Reflexionsmodus in einer eigens dafür konstruierten Meßzelle ermittelt. In diese können Oberflächen-Proben eingesetzt und gemessen werden; sie eignet sich für die Messung an Proben, die zuvor an interessierenden Stellen exponiert waren. In einer Durchflußzelle wurden die entsprechenden Eigenschaften natürlich entstandener Beläge untersucht. Für diese Zelle wurde ein spezieller Sensorkopf entwickelt und angefertigt, der für zerstörungsfreie On-line-Messungen in technischen Systemen geeignet ist und mit der entsprechenden Signalauswertung eingesetzt werden kann.

Zum Nachweis des biologischen Anteils in einem Biofilm wurden zwei Methoden verwendet:

a) Die Nutzung der Fluoreszenz biologischer Moleküle nach Färbung mit bekannten Fluoreszenzfarbstoffen (DAPI, Acridin-Orange, Propidium-Iodid u. a.). Mit Ausnahme von Acridin-Orange wurde ein linearer Zusammenhang zwischen der meßtechnisch erfaßten Fluoreszenzintensität und den Biofilm-Parametern nachgewiesen. Die Methode kann unter Labor- und Feldbedingungen zur Untersuchung von Umweltproben angewandt werden.

b) Die Nutzung der natürlichen Fluoreszenz ohne weitere Markierung erfolgt über die Auswertung von Fluorophoren, die im Biofilm vorkommen. Als geeignet hat sich hier die Tryptophan-Bande erwiesen. Hier ist allerdings die Quantenausbeute im Vergleich zu Markersubstanzen wesentlich geringer, deswegen ist auch die Signalerfassung komplizierter. Die Aquisitionszeiten für ein Spektrum beträgt mehrere Minuten.

Die Untersuchungen wurden an Biofilm-Suspensionen, an dehydratisierten und voll hydratisierten Biofilmen vorgenommen. Die aufgenommenen Spektren wurden mit Hilfe mehrerer mathematischer Funktionen bearbeitet und zum Schluß einer Dekonvolution unterzogen.

Es wurde nachgewiesen, daß beide Systeme, d.h. die Meßzelle für einzusetzende Proben und die Durchflußzelle, funktionieren und in der Lage sind, biologisches Material zu erkennen; sie zeigen einen linearen Zusammenhang zwischen Biofilm-Dicke und Wachstumsdauer. Sie stellen die Grundlagen für eine automatisierbare Meßmethode dar, mit der biotisches von nichtbiotischem Material unterschieden werden kann.

Die weitere Perspektive für die Systeme besteht darin, sie auf den Einsatz in der praktischen Applikation hin zu optimieren.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Die Ergebnisse der Arbeiten werden 1999 und 2000 in einer Reihen von wissenschaftlichen Publikationen veröffentlicht.


Fazit

Im Rahmen des Forschungsprojektes wurde ein Meßsystem entwickelt, mit dem es möglich, wird zwischen biotischem und abiotischem Anteil in einem Biofilm zu unterscheiden. Die Methode ist an nativen Biofilmen in wäßrigen Systemen mit Hilfe eines eingebauten Meßkopfes und an Proben auf Coupons mit Hilfe einer Meßzelle anwendbar. Ausgewertet wird die extrinsische Fluoreszenz von markierten Biomole-külen und die intrinsische Fluoreszenz relevanter biologischer Moleküle. Die Methode kann automatisiert werden und zur on-line, zerstörungsfreie und in Echtzeit Überwachung der Belagsbildung in technischen Wassersystemen angewendet werden.