Projekt 06843/01

Optimierung der chemischen Schnellanalytik zum Nachweis des Algentoxins Domoinsäure in biogenen Proben

Projektträger

Zentrum für Flachmeer-, Küsten- undMeeresumweltforschungForschungszentrum TERRAMARE e. V.
Schleusenstr. 1
26382 Wilhelmshaven
Telefon: 04421/944-0

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Mit dem ersten Auftreten 1992 der toxischen Diatomee Pseudo-Nitzschia pungens forma multiseries in Gewässern des Wattenmeers ergab sich die Notwendigkeit, Nachweismethoden für das gebildete Toxin Domoinsäure zu entwickeln. Dabei sollte versucht werden, apparativ wenig aufwändige Verfahren zu entwickeln. Diese Verfahren sollten intrinische molekulare Eigenschaften des Toxins nutzen. In der Vorphase des Vorhabens gelang es, entsprechende colorimetrische Nachweismethoden mit Dünn-schichtchromatographie zu kombinieren. In der Hauptphase wurde dieses Verfahren zur Anwendungs-reife für die Untersuchung von realen Proben weiterentwickelt.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie bislang an definierten Standards (ausgewählte Aminosäuren, Domoin- (DA) und Kaininsäure) erfolgreiche Trennung in toxische und nichttoxische Substanzen wurde auf komplexere Gemische aus natürlichen oder naturähnlichen Proben ausgeweitet. Hierzu zählen u. a. in den zur DA-Extraktion benutzten Lösungsmitteln ebenfalls lösliche Lipide und andere Aminosäuren bzw. kurzkettige Peptide. Ein Reinigungsschritt hierfür wurde optimiert. In diesem Schritt werden kommerziell erhältliche Adsorptionskartu-schen eingesetzt, um unpolare Verunreinigungen aus Gesamtextrakten zu entfernen.
Um toxinhaltige Miesmuscheln in ausreichender Menge zur Verfügung zu haben, wird die verursachende Kieselalge in größeren Ansätzen kultiviert. Die erhaltene Algensubstanz wird nach Bestimmung des Toxingehalts an Muscheln in Aquarienhälterung verfüttert. Besonders die Algenkultivierung war relativ zeitaufwändig und bedurfte ständiger Kontrolle.
Nach einer Reihe von Versuchen gelang es, DA von anderen Aminosäuren mit Dünnschichtchromatographie an Umkehrphase (C18) abzutrennen. Eine selektive Detektion gelang mit Natriumnitroprussid.


Ergebnisse und Diskussion

Die in der Vorphase des Projekts entwickelten Reaktoren zur Züchtung größerer Mengen toxischer Diatomeen wurden erfolgreich weiter genutzt. Um ausreichende Mengen toxinhaltiger Miesmuscheln zur Verfügung zu haben, wurden die Algen in einfachen Laboransätzen an die Muscheln verfüttert.
Zunächst wurden die Extraktionsverfahren und die Aufreinigungsschritte, die vor allem bei der Analyse kontaminierter Muscheln notwendig sind, optimiert. Dabei zeigte sich, dass Festphasenextraktion über Anionenaustauschharze am besten geeignet sind, störende Begleitkomponenten aus der Matrix zu entfernen. Dabei werden in der Regel Wiederfindungsraten von über 90 % erzielt.
Wegen der nicht unerheblichen Kosten beim Einsatz dieser Extraktionskartuschen wurde untersucht, inwieweit sich diese Einmalkartuschen, gegebenenfalls nach Reinigung, wieder verwenden lassen. Es zeigte sich, dass dies möglich ist, solange die Absorberharze nicht verfärbt sind.
Von den verschiedenen Extraktionsmitteln erwies sich Methanol/Acetatpuffer als am besten geeignet, um das Toxin aus der komplexen Matrix Muschelfleisch nahezu quantitativ zu erhalten.
Ausgehend von den Ergebnissen der Vorphase wurde die dünnschichtchromatographische Abtrennung der Toxine von anderen im aufgereinigten Extrakt enthaltenen Verbindungen, z. B. freie Aminosäuren, weiter optimiert. Dabei erwies sich eine C18-Umkehrphase als am besten geeignet. Als Nachweisrea-gens wurde Natriumnitroprussid eingesetzt. Dies hat den Vorteil, dass es spezifisch mit Imino- und Prolylaminosäuren zu einem blauen Farbstoff reagiert. Daneben kann Vanillin eingesetzt werden, das orange-gelben Farbstoff ergibt. Die gereinigten (s.o.) Extrakte aus Muscheln wurden zunächst mit HPLC quantitativ auf ihren Toxingehalt untersucht. Für Planktonproben erwies sich eine Reinigung als nicht notwendig. Parallel dazu wurde an denselben Proben die optimierte DC durchgeführt, um die Nachweisgrenze zu bestimmen.
Beide verwendeten Regantien haben Nachweisgrenzen von 20 µg DA/mL Rohextrakt bzw. 9 µg DA/mL gereinigtem Extrakt. Eine eindeutige Ja/Nein-Aussage ist noch bei Konzentrationen von 9 bzw. 0,9 µg DA/mL möglich. Damit liegen die Nachweisgrenzen unter den von der WHO geforderten 21 µg/g Muschelfleisch (= 13 µg/mL aufgereinigter Extrakt).
Das entwickelte Verfahren ist damit geeignet, als Routinemethode für semiquantitative Voruntersuchungen auf Domoinsäurekontamination verwendet zu werden. Es kann als erheblich kostengünstigere Alternative in der Lebensmittelüberwachung eingesetzt werden, muss aber bei positiven Befunden durch eine quantitative Bestimmung mit HPLC ergänzt werden.
Ein Teil der beschriebenen Arbeiten wurde in Kooperation mit Dr. Roger Pocklington, Bedford Institute of Oceanography, Dartmouth, Nova Scotia, Canada, durchgeführt.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Die Arbeiten wurden 1997 auf dem Jahrestreffen der Kanadischen Chemischen Gesellschaft vorgestellt und diskutiert.
Eine Publikation über die Endergebnisse ist in Vorbereitung.


Fazit

Die Ziele des Vorhabens wurden damit erreicht.