Projekt 13040/07

Förderschwerpunkt Biotechnologie: Verbund Industrielle Nutzung von Biokatalysatoren: Biotechnologische Gewinnung eines hochwertigen Futtermitteladditivs aus Abfallfedern durch extremophile Mikroorganismen

Projektträger

Technische Universität Hamburg-HarburgArbeitsbereich 2.09Bioprozeß- und Bioverfahrenstechnik
Denickestr. 15
21071 Hamburg
Telefon: 040/42878-3017

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

In einem innovativen Verfahren soll durch extremophile Mikroorganismen ein hochwertiger aminosäuren- und peptidreicher Futtermittelzusatz gewonnen werden. Dabei wird die Entsorgung eines Abfallstoffs mit der Gewinnung eines vermarktbaren Produkts kombiniert und auf ökologisch und ökonomisch vorteilhafte Weise ein Beitrag zum produktionsintegrierten Umweltschutz geleistet sowie der Vorgabe des Kreislaufwirtschafts- und Abfallgesetzes zur vorrangigen Abfallweiterverwertung gegenüber der Beseitigung entsprochen. Das Ziel des vorliegenden Forschungsantrags ist die biotechnologische Gewinnung einer komplexen Mischung von Proteinhydrolysaten aus Abfallfedern, die bei Geflügelschlachtereien in großen Mengen anfallen. Die Federn galten bislang als biologisch schwer abbaubar und werden heutzutage größtenteils chemisch-physikalisch zu Federmehl verarbeitet. Das neu zu entwickelnde Verfahren soll eine wirtschaftlich rentable Gewinnung eines proteinreichen Futtermitteladditivs ermöglichen.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenFür den biologischen Abbau soll der an der TUHH bereits isolierte hyperthermophile Mikroorganismus Fervidobacterium pennivorans oder seine aufgereinigten Enzyme eingesetzt werden. Um den Abbau der Federn zu einem vermarktbaren proteinreichen Futtermitteladditiv in ein wirtschaftlich rentables Verfahren zu integrieren, soll die Raum-Zeit-Ausbeute durch die Anwendung eines Membranverfahrens deutlich gesteigert werden. Nach Optimierung der Betriebsbedingungen im Labormaßstab und Auswahl ge-eigneter Membranmodule soll in Kooperation mit dem in der anaeroben Abfallverwertung erfahrenen und über die logistischen Voraussetzungen verfügenden Verwertungsunternehmen Biokraftwerke Fürstenwalde GmbH und Geflügelschlachtereien eine Anlage im Technikumsmaßstab realisiert werden. Durch eine Wirtschaftlichkeitsanalyse und umfangreiche Recherche sollen außerdem die Marktfähigkeit des Verfahrens und die entscheidenden Scale-up-Kriterien bestimmt werden, um später eine schnelle Markteinführung zu gewährleisten.


Ergebnisse und Diskussion

Um die Umsetzung von Keratinen zu Aminosäuren und Peptiden effektiv durchführen zu können, ist es erforderlich rekombinante thermostabile Proteasen in großen Mengen zu produzieren. Obwohl die Keratinase aus Fervidobacterium pennivorans in E. coli kloniert werden konnte, konnte kein aktives Enzym exprimiert werden (Kooperation: Prof. W. de Vos, Kluskens et al., 2002). Als Alternative zur Keratinase aus F. pennivorans wurde ein neuer Stamm Thermoanaerobacter keratinophilus auf die Fähigkeit Kera-tin abzubauen untersucht. Es wurde ein in vivo Abbau von Keratin durch eine extrazelluäre Serin-Protease nachgewiesen. Die Protease arbeitet in einem breiten Temperatur- und pH-Spektrum mit einer optimalen Aktivität bei 85°C und pH 8,0. Durch den Einsatz von degenerierten Primern, die Teilsequenzen der katalytischen Triade einer Serinprotease flankieren, konnte die Protease kodierende Sequenz aus T. keratinophilus detektiert werden. Diese Sequenz konnte in den Expressionsvektor pQE30 ligiert werden und es wurde der Nachweis erbracht, dass die Protease aktiv exprimiert wird. Damit ist der Weg frei für die geplante in vitro Untersuchung. Ein weiterer Ansatz war die Klonierung der Protease kodierenden Sequenz in B. megaterium. Das Proteasegen konnte in dem von Prof. Dr. Jahn am Institut für Mikrobiologie der TU Braunschweig zur Verfügung gestellten Vektor pMM1520 kloniert werden. Die Transformation in Bacillus megaterium ist gelungen, so dass das heterologe Gen aktiv exprimiert wird, jedoch findet zz. noch keine Sekretion statt.
Da der in vivo Abbau hinsichtlich eines technischen Verfahrens zu niedrig ist, wurde die Variante eines Zwei-Stufen-Prozesses gewählt, bei der erst das Enzym mit dem Wildstamm Thermoanaerobacter keratinophilus produziert und im zweiten Schritt mit Hilfe dessen Protease der Abbauprozess durchgeführt wird, da erst jetzt ein Produktionsstamm vorliegt. Erfolg versprechende Kultivierungsergebnisse im Vial wurden vergleichend im Fermenter untersucht, allerdings zeigte sich hier eine deutlich reduzierte Enzymproduktivität als im Vial (Vial: 600-900 U/l, Fermenter:130 - 150 U/l). Für den Wildstamm ergibt sich das anfangs eingesetzte Medium mit Begasung von Stickstoff nur während der Lag-Phase. In diesem Fall wurden etwa 130 U/l erreicht, allerdings waren die Fermentationen nicht Scale-up fähig. Mit dem rekombinanten E. coli hingegen wurde ein Fedbatch-Verfahren entwickelt, welches 4000 U/l Enzymaktivität lieferte. Das Verfahren mit exponenzieller Fütterung und Temperaturabsenkung nach Induktion mit IPTG auf 28°C konnte erfolgreich in den 30 l-Maßstab überführt werden, so dass nun ausreichend rekombinantes Enzym für Abbauversuche zur Verfügung steht. Die Protease von T. keratinophilus weist mit 54h Halbwertzeit eine mehr als 10fach höhere Temperaturstabilität als kommerziell erhältliche Proteasen auf und ist damit ideal für die Zielsetzung des umweltschonenden Federabbaus geeignet. Es konnte ein Umsatz von 37 g/l bei 100 g/l Federn binnen 24h nachgewiesen werden. Mit den Ergebnissen der Laborversuche zum Federabbau mit direktem Einsatz von Enzymen ist es derzeit noch nicht vor-stellbar, eine Anlage zur biotechnologischen Federverwertung aufzubauen und mit wirtschaftlichem Erfolg zu betreiben, weil die Abbaugrade deutlich unter den angestrebten 90% liegen. Falls diese erreicht werden sollten, bietet sich angesichts der EU-Hygienevorschriften für nicht zum menschlichen Verzehr bestimmte tierische Nebenprodukte vorwiegend der Einsatz als Zuschlagstoff für die Herstellung von Kleintierfutter an.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

- Kluskens, L.D., Voorhorst, W.G.B., Siezen, R.F., Schwertfeger, R.M., Antranikian, G., van de Oost, J., de Vos, W.M. (2001): Molecular characterization of fervidolysin, a subtilisin-like serine protease from the thermophilic bacterium Fervidobacterium pennivorans. Poster presentation on the Third International Kongress on Extremophiles.
- Rießen, S., Antranikian, G. (2001): Isolation of Thermoanaerobacter keratinophilus sp. nov., a novel thermophilic anaerobic bacterium with keratinolytic activity. Extremophiles 5: 399-408.
- Brodersen, J., Goedde, C., Fuchs, C., Rießen, S., Antranikian, G. and Märkl, H. (2001): Biotechnologische Verwertung von Abfallfedern mit Hilfe extremophiler Mikroorganismen. Sonderband Biokatalyse der DBU.
- Kluskens, L.D., Voorhorst, W.G.B., Siezen, R.F., Schwertfeger, R.M., Antranikian, G., van de Oost, J., de Vos, W.M. (2002): Molecular characterization of fervidolysin, a subtilisin-like serine protease from the thermophilic bacterium Fervidobacterium pennivorans. Extremophiles 6:185-194.
- Brodersen, J., Rießen, S., Antranikian, G., Märkl, H. (2002): From isolation to application: degradation of ß-keratin by a novel extremthermophilic bacterium, Thermoanaerobacter keratinophilus. Posterpräsentation , Extremophiles 2002.
- Brodersen, J., Rießen, S., Antranikian, G., Märkl, H. (2002): Degradation of ß-keratine by extremophilic bacteria. Posterpräsentation, Biocat 2002.
- Brodersen, J., Rießen, S., Antranikian, G., Märkl, H. (2003): Umweltfreundliche Aufbereitung von Hühnerfedern mittels extrem thermophiler Bakterien und thermostabilen Enzymen, Trankskript Sonderband 2003, 17-19. Referenzen
- Baneyx, F. (1999): Recombinant protein expression in Escherichia coli. Curr. Opin. Biotechnol. Vol. 10: 411-421.
- Friehs, K.H. (1999): Maßnahmen zur Verbesserung der Produktion von rekombinanten Proteinen und Plasmid-DNS. Habilitationsschrift.
- Lee, J. , S.Y., Park, S., Middelberg, A.P.J. (1999): Control of fed-batch fermentations. Biotechnol. Adv. Vol. 17: 29-48.
- Meinhardt, F., Busskamp, M., Wittchen, K.D. (1994): Cloning and sequencing of the leu C and npr M genes and a putative spo IV gene from Bacillus megatrium DSM 319. Applied Microbiology and Biotechnology 41: 344-351.
- Wittchen, K.D., Meinhardt, F. (1995): Inactivation of the major exracellular protease from Bacillus megaterium DSM 319 by gene replacement. Applied microbiology and Biotechnology 42: 871-877.


Fazit

Es konnte gezeigt werden, dass Gene aus extremophilen Mikroorganismen, die Proteasen kodieren, erfolgreich aktiv intrazellulär in E. coli und Bacillus megaterium exprimiert werden können. Damit ist der Weg frei für die geplante in vitro Untersuchung.
Nachdem mit dem Wildstamm nur für den Labormaßstab Enzyme für den Federabbau in vitro produziert werden konnten, ist es uns gelungen mit dem rekombinanten E. coli im Fedbatch-Verfahren mit exponenziell gesteuerter Fütterung zu entwickeln, mit dem ausreichende Enzyme produziert werden konnte. Protease von T. keratinophilus weist eine mehr als 10fach höhere Temperaturstabilität als kommerziell erhältliche Proteasen auf und ist damit für die Zielsetzung des umweltschonenden Federabbaus geeignet. Allerdings lassen sich nur Abbaugrade von 37 % bei 100 g/l Federn erzielen.