Projekt 13028/05

Förderschwerpunkt Biotechnologie: Verbund Sensorik in der Biotechnologie: Prozessoptimierung der Oxidase-katalysierten L-Aminosäuregewinnung

Projektträger

Universität HohenheimInstitut für LebensmitteltechnologieLehrstuhl Biotechnologie
Garbenstr. 25
70593 Stuttgart
Telefon: 0711/459-3018/-2311

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Bei der biotechnologischen Herstellung (Batch-Biotransformationsprozess) reiner L-Aminosäuren/ a-Ketosäuren mittels D-Aminosäureoxidase (D-AO; intrazellulär immobilisiert) stehen momentan noch keine ausreichend sensitiven und selektiven Analysemethoden für die Prozesskontrolle zur Verfügung. Problematisch ist das bei Oxidationsprozessen äquimolar zum Substrat entstehende Wasserstoffperoxid (H2O2), das den Biokatalysator denaturiert, eine Nebenproduktbildung verursacht und somit die a-Ketosäureausbeute signifikant verringert. Ziel dieses Projekts war die Verfahrensoptimierung durch eine automatische, sensorgesteuerte Zugabe von Katalase, um die durch das Peroxid resultierenden Probleme zu beheben.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie Prozessoptimierung sollte in drei ineinander übergehenden Projektabschnitten realisiert werden. Im ersten Projektabschnitt wurde die angestrebte Automatisierung durch den Einsatz einer online Fließinjektionsanalyse (FIA) mit Enzymsensor verfolgt. Hierzu erfolgte ein Screening nach geeigneten Peroxidasen und Untersuchungen zur Herstellung von Peroxidase-Immobilisaten zur sensitiven, spektralphotometrischen Detektion von H2O2 mit geeigneten Chromogenen (9 Monate).
Es folgten Biotransformationen mit unterschiedlichen Substraten und verschiedenen Biokatalysatorformen ohne und mit externer Katalasezugabe. Verschiedene kommerziell erhältliche Katalasen wurden hinsichtlich ihrer eigenen Prozessstabilität, der Kinetik des H2O2-Abbaus, der a-Ketosäureausbeute und der Beeinflussung der D-AO-Aktivität bei Umsetzungen mit rac-Phenylalanin unter Verwendung des D-AO-Immobilisats untersucht. (21 Monate).
In den Versuchen mit permeabilisierten und quervernetzten T. variabilis-Zellen zeigte sich, dass das Redoxpotenzial eine mögliche Stellgröße zur Steuerung einer automatischen Katalasezudosage sein könnte. Eine robuste online Redoxelektrode hätte gegenüber dem FIA-System Vorteile hinsichtlich der Schonung von Ressourcen (Enzym, Chromogen, Abwasser) und der wesentlich praktikableren Integration in eine Mess- und Regelanlage. Zu diesem Zweck wurde im letzten Projektabschnitt untersucht, ob diese physikalisch-chemische Elektrode als mögliche Stellgröße für eine automatische Katalasezudosage ver-wendet werden kann (6 Monate).


Ergebnisse und Diskussion

In der ersten Projektphase erfolgte ein Screening nach geeigneten Enzymen, die Etablierung photometrischer Assays mit Originalproben des Bioprozesses sowie die Immobilisierung der Enzyme und die Charakterisierung der Immobilisate, um eine FIA zur Detektion von H2O2 aufbauen zu können. Dabei stellte sich heraus, dass sich prinzipiell die Peroxidase aus Arthromyces ramosus (Eupergit-Immobilisat) in Kombination mit ABTS [2,2-Azino-bis-3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure] als Chromogen für den Einsatz in eine FIA eignet. Da sich in anschließenden Biotransformationen mit ganzen, permeabilisierten und quervernetzten T. variabilis-Zellen das Redoxpotenzial als mögliche Messgröße zur Steuerung einer automatischen Katalasezudosage aufdrängte, wurde der Einsatz einer FIA vorerst nicht weiter verfolgt. Bei Biotransformationen mit rac-Methionin ohne externe Katalasevorlage unter Verwendung permeabilisierter, quervernetzter Zellen wurde eine a-Ketosäureausbeute von 63 % erzielt (Rest-D-AO-Aktivität 20 %). Mit externer Katalasevorlage konnte die a-Ketosäureausbeute auf 93 % erhöht werden (Rest-D-AO-Aktivität 80 %).
Bei Einsatz von D-AO-Immobilisat im Umsetzungsprozess lag die Ketosäureausbeute ohne Katalasezugabe mit rac-Methionin bei 20% (Rest-D-AO-Aktivität ca. 100 %). Bei externer Zugabe von Katalase aus Rinderleber oder Aspergillus niger und rac-Phenylalanin bzw. rac-Methionin wurden a-Ketosäureausbeuten von 70 - 80 % erreicht. Mit der Katalase aus Micrococcus lysodeikticus konnte die Nebenproduktbildung bei Biotransformationen von Phenylalanin vollständig unterdrückt werden (100 % a-Ketosäure- und L-Aminosäureausbeute, Rest-D-AO-Aktivität ca. 80 %). Bezogen auf die a-Ketosäurebildung ohne externe Zugabe von Katalase erhöhte sich die Raum-/Zeit-Ausbeute von 0,14 g L-1h-1 auf 8,26 g L-1h-1. Da bei Zusatz von Katalase aus Rinderleber und Aspergillus niger kein Aktivitätsverlust der D-AO zu beobachten war, bliebe die Ursache der Aktivitätsabnahme bei Zusatz von Micrococcus-Katalase noch zu klären.
Im letzten Projektabschnitt wurde untersucht, ob sich das Redoxpotenzial tatsächlich als Messgröße zur Steuerung einer automatischen Katalasezudosage eignet. Die Korrelation zwischen gebildeter H2O2-Menge, Katalaseaktivität und Messsignal des Redoxpotenzial-Sensors wurde anhand eines Ganz-Zell-Modells und in Biotransformationen mit D-AO-Immobilisat verifiziert. Es stellte sich aber heraus, dass die Sensitivität des eingesetzten Redoxpotenzial-Sensors im Prozess nicht ausreichte, um eine Katalasezudosage zu garantieren, die eine Nebenproduktbildung effizient unterbinden würde.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Müller K.M., Gabler M., Fischer L. (1999): Enzymatische Ketosäureproduktion beim Einsatz mikrobieller D-Aminosäureoxidasen, VAAM-Jahrestagung, Göttingen.
Gabler M., Fischer L. (1999): Bioanalytik Oxidase-katalysierter L-Aminosäuregewinnung, 17. DECHE-MA-Jahrestagung der Biotechnologen, Wiesbaden.
Trost E.M., Bashir I., Fischer L. (2000): Prozessoptimierung der Oxidase-katalysierten L-Aminosäuregewinnung, 10. Heiligenstädter Kolloquium Technische Systeme für Biotechnologie und Umwelt, Heiligenstadt.
Trost E.M., Bashir I., Fischer L. (2001): Prozessoptimierung der L-Aminosäureproduktion mittels D-Aminosäureoxidase, 19. DECHEMA-Jahrestagung der Biotechnologen, Leipzig.
Trost E.M., Bashir I., Fischer L. (2001): Minimization of by-product formation during D-amino acid oxidase catalysed production of L-amino acids, BioTrans, Darmstadt.
Trost E.M, Borck A., Bashir I., Fischer L. (2001): Prozessoptimierung der Oxidase-katalysierten L-Aminosäuregewinnung, Biospektrum, Sonderausgabe Sensorik, 15-18.
Trost E.M., Fischer L. (2002): Minimization of by-product formation during D-amino acid oxidase catalyzed racemic resolution of D/L-amino acids, J. of molecular catalysis B: enzymatic, 19-20: 189-195.


Fazit

Das Redoxpotenzial erwies sich als Kontrollparameter für eine automatische Katalasezudosage als ungeeignet. Folglich könnte für eine Automatisierung auf den Einsatz einer FIA mit Enzymsensor zurückgegriffen werden. Die Voraussetzungen hierfür sind in dem Projekt entwickelt worden. Auch ohne einen automatisierten Prozess wurde durch Wahl einer geeigneten Katalase mit D-AO-Immobilisat eine a-Ketosäure- und L-Aminosäureausbeute von 100 % erzielt. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass das verfügbare D-AO-Immobilisat gegenüber den permeabilisierten, quervernetzten Zellen auf Grund seiner höheren Prozessstabilität und leichteren Handhabung vorzuziehen ist. Die Integration eines Sen-sors in den in diesem Projekt optimierten Prozess erscheint aus ökonomischer und ökologischer Sicht nicht mehr zwingend notwendig.