Entwicklung eines Real-Time-PCR-Verfahrens zur Untersuchung von mikrobiellem Bewuchs auf Materialien im Trinkwassergebrauch

Stipendiatin/Stipendiat: Polina Petrova

Problemstellung der Forschungsarbeit:In der Trinkwasserversorgung sind für den Behälter- und Rohrleitungsbau Metalle und mineralische Werkstoffe gebräuchlich. Zum Korrosionsschutz kamen zusätzlich schon früh Beschichtungen mit organischen Werkstoffen auf, die in der Folgezeit durch Neuentwicklungen um verschiedene Stoffgruppen erweitert wurden.Im Zuge der Anwendung solcher Beschichtungen und Auskleidungen von Behältern und Leitungen wurde eine Zunahme der Bakterienzellzahl im Wasser beobachtet. Die Verkeimungen - festgestellt als Koloniezahlerhöhung - kamen dadurch zustande, daß organische niedermolekulare Verbindungen aus der Beschichtung einen mikrobiellen Bewuchs (Biofilm) fördern, von dem die Bakterien in das freie Wasser übergingen. Die Ausbildung von Biofilmen im Trinkwasser ist nicht zu tolerieren, da Biofilme ein potentielles Habitat für unerwünschte oder pathogene Mikroorganismen sein können. Um eine mikrobielle Beeinträchtigung des Trinkwassers durch Materialien auszuschließen, dürfen im Trinkwasser nur solche Werkstoffe eingesetzt werden, die im Kontakt mit Wasser nicht zu einer Vermehrung von Mikroorganismen führen.Allen Verfahren ist zu eigen, daß Meßzeiten von mehreren Monaten benötigt werden bis eine Aussage über das Wachstum von Mikroorganismen auf den getesteten Materialien gemacht werden kann. Hinzu kommt, daß die Quantifizierung mit diesen Verfahren z. T. schwierig ist und bei der Methode nach W270 es zu Fehlmessungen durch nicht-biologische Ablagerungen auf dem Testmaterial kommen kann. In der vorliegenden Projektskizze wird die Entwicklung eines molekularbiologischen Verfahrens beschrieben, das mikrobiellen Bewuchs von Materialien im Trinkwasser-gebrauch quantitativ analysiert und in 4 Wochen Ergebnisse liefern soll, die eine Be-wertung von Materialien erlaubt.Das Ziel:Ziel des Vorhabens ist es, eine real-time PCR-Methode (RT-PCR) zu entwickeln, die den Bewuchs von Materialien im Trinkwasser durch Mikroorganismen innerhalb von 4 Wochen quantitativ bestimmen kann. Es ist beabsichtigt, das Verfahren so auszulegen, daß sowohl der Nachweis von Prokaryonten als auch eukaryontische Mikro-organismen/Parasiten möglich ist. Angaben zur Vorgehensweise und Methoden:Der Nachweis von Bakterienwachstum auf Materialien im Trinkwasser durch RT-PCR soll an Kunststoffen etabliert werden, die bereits mit dem Verfahren W270 überprüft wurden. Die Testmaterialien werden wie in dem Verfahren W270 beschrieben in ein Testbecken eingebracht und mit Trinkwasser umspült. Dies bietet den Vorteil, daß mit der natürlichen Mikroorganismenpopulation des Trinkwassers getestet wird. Zur Untersuchung mit RT-PCR werden die zu testenden Kunststoffteile mit definierter Größe direkt in die PCR-Reaktionsgefäße überführt, mit Ultraschall behandelt und für 15 min auf 94° C in der PCR-Maschine erhitzt, so daß die Zellen lysieren und die DNA freigesetzt wird. Alternativ kann von einer definierten Fläche des Kunststoffs die Zellen der Primärbesiedelung abgenommen und in das Reaktionsgefäß für die PCR-Untersuchung überführt werden. Die RT-PCR wird mit universellen Primern nach Rivas et al. (2004) durchgeführt, die die Amplifikation der 16S-RNA-Gene aus Prokaryonten und der 18S-RNA-Gene aus eukaryontischen Mikroorganismen erlaubt. Der Nachweis der gebildeten DNA erfolgt mit Hilfe des Farbstoffs SYBR-Green. Die Zellzahl wird über relative Quantifizierung bestimmt. Im Vergleich mit verschieden konzentrierten Standards definierter Zellzahl kann die Zellzahl im Testansatz ermittelt werden. Die direkte Verwendung von Bakterien (Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum) als Standard im PCR-Ansatz wird an DNA-Standards unterschiedlicher Konzentration, die aus Zellen definierter Zahl isoliert wurde, überprüft. Des weiteren muß sichergestellt werden, daß eine Vielzahl verschiedener Zelltypen durch Ultraschall und Hitzeinkubation lysiert werden und die freigewordene DNA durch PCR amplifizierbar ist. Als Modellorganismen werden E. coli, Bacillus subtilis, C. glutamicum, Saccharomyces cerevisiae und Aspergillus niger getestet. Praktische Anwendung:Das RT-PCR-Verfahren zur Materialuntersuchung im Trinkwasser wird mit dem Ziel entwickelt, die bisherigen Testmethoden in der praktischen Anwendung zu ersetzen und ein Verfahren an die Hand zu bekommen, das die klassischen Methoden als normative Verfahren ersetzen soll.

Förderzeitraum:
01.03.2007 - 31.12.2007

Institut:
Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung
Fachgruppe IV. 1

Betreuer:
Dr. Hans-Jörg Kunte

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Entwicklung eines Real-Time-PCR-Verfahrens
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