Entwicklung einer effektiven Produktionsmethode für bioaktive Chitosan Oligomere mittels Proteinengineering von Chitosanasen

Stipendiatin/Stipendiat: Eva Katharina Regel

Chitosan ist eines der in der Natur am häufigsten vorkommenden Biopolymere und als Abfallprodukt der Krabbenindustrie in großen Mengen verfügbar. Es ist nicht-toxisch, biologisch abbaubar und biokompatibel. Außerdem wurde für Chitosan in zahlreichen Tests eine pflanzenschützende Wirkung nachgewiesen. Für die Hochertrags-Landwirtschaft in Deutschland ist ein biologischer Pflanzenschutz mit Chitosan aber noch nicht effizient und zuverlässig genug. Ein vielversprechender Ansatz der letzten Jahre ist die Verwendung von Chitosan in Verbindung mit klassischen organischen oder anorganischen Pestiziden. Die Verwendung von Chitosan zum Pflanzenschutz verlangt im Besonderen ein noch besseres Verständnis der Bioaktivität auf molekularer Ebene, da Chitosane eine heterogene Gruppe von Biopolymeren sind, die sich im Grad der Polymerisierung, im Grad der Acetylierung und im Muster der Acetylierung unterscheiden. Zudem wird vermutet, dass die bioaktive Wirkung aus dem Abbau des Chitosans zu Chitosan Oligomeren (paCOS) durch die auf der Pflanze vorkommenden hydrolytischen Enzyme resultiert. Bei der chemischen Herstellung von Chitosan und paCOS werden große Mengen an Säure und Base benötigt und sehr heterogene Produktgemische entstehen. Die biotechnologische Produktion von paCOS mit Enzymen kann bei umweltfreundlicheren Bedingungen durchgeführt werden und generiert aufgrund von hoher Substratspezifität der Enzyme homogenere und effektivere Produkte. Enzyme, die sich für die Herstellung von paCOS eignen, sind Chitosanasen, welche Chitosanpolymere zu paCOS hydrolysieren. Die Bandbreite von definierten paCOS, die sich auf diese Weise herstellen lassen, wird bisher durch die natürlich vorkommenden Substratspezifitäten der charakterisierten Enzyme limitiert. Das Proteinengineering solcher Enzyme kann diese Limitierungen überwinden und das Spektrum von definierten paCOS erweitern.  

Ziel dieses Promotionsvorhabens ist die Entwicklung einer skalierbaren Produktionsmethode für bioaktive paCOS als zuverlässige Pflanzenschutzmittel mit Hilfe von gezieltem Proteinengineering einer geeigneten Chitosanase. Dazu sollen zunächst spezifische paCOS, die eine zuverlässige bioaktive Wirkung zeigen, durch Verwendung verschiedener Bioassays und der Nutzpflanze Reis ermittelt werden. Anschließend soll die Substratspezifität von Chitosanasen mit gezieltem Proteinengineering optimiert werden, sodass besonders bioaktive paCOS effizient produziert werden (doi: 10.1002/bit.26533). Zudem sollen die Chitosanasen auch hinsichtlich ihrer spezifischen Aktivität und Stabilität optimiert werden. Dazu werden bioinformatische Methoden wie Homologiemodeling und in silico Docking eingesetzt und eine Mutantenbibliothek erstellt. Aus dieser Mutantenbibliothek wird durch systematisches Screening mit einem photometrischen Assay und Massenspektrometrie der perfekte Mutant ausgewählt. Abschließend findet ein Upscaling der enzymatischen paCOS Produktion im Labor- und Pilotmaßstab statt.

Förderzeitraum:
01.12.2016 - 30.11.2019

Institut:
Westfälische Wilhelms-Universität Münster
Institut für Biochemie und Biotechnologie der Pflanzen

Betreuer:
Prof. Dr. Bruno Moerschbacher

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Publikationen: