Charakterisierung ausgewählter Cytochrome P450 aus Sorangium cellulosum So ce56 - Neue potentielle Biokatalysatoren

Stipendiatin/Stipendiat: Dr. Michael Ringle

Cytochrome P450 (kurz P450) erfreuen sich in den letzten Jahren immer größerer Beliebtheit als Biokatalysatoren. Dies liegt an ihrer Fähigkeit, als Monooxygenasen atomaren Sauerstoff in nicht aktivierte C-H-Bindungen einzuführen. In Folge der steigenden Anzahl von Genom-veröffentlichungen stieg auch die Diversität dieser Enzymfamilie und die damit zusammen-hängenden Möglichkeiten in ihrer Anwendung als Biokatalysatoren. Die Forschungsgruppe von Frau Prof. Rita Bernhardt beschäftigt sich seit 2006 mit den 21 Cytochromen P450 und den zugehörigen Redoxsystemen aus dem Myxobakterium Sorangium cellulosum So ce56 und deren physiologischen und biokatalytischen Eigenschaften (Ewen 2009, Khatri 2009). In dieser Arbeit sollten die zuvor erhaltenen Erkenntnisse über die Cytochrome P450 CYP109D1, CYP260A1, CYP260B1, CYP264A1 und CYP266A1 vertieft und neue Substrate und Produkte charakterisiert werden. Hierfür wurden die einzelnen Proteine in E. coli rekombinant exprimiert und mit den gereinigten Enzymen mögliche Substrate identifiziert. Um für die anschließende Produktcharakterisierung ausreichende Produktmengen herzustellen, wurde ein universell einsetzbares Escherichia coli Ganzzellsystem etabliert, bei dem das jeweilige Cytochrom P450 mit einem heterologen Redoxsystem, bestehend aus Adrenodoxinreduktase (AdR) und C-terminal verkürztem Adrenodoxin (Adx4-108), coexprimiert wurde. Dieses System konnte durch den Austausch der schwer exprimierbaren AdR durch die E. coli eigene Reduktase (Fpr) entscheidend optimiert werden. Gleichzeitig wurde durch den Einsatz des M9CA-Minimalmediums, welches in dieser Arbeit erstmals verwendet wurde, der negative Einfluss der beobachteten Indolproduktion von E. coli auf die P450 Biotransformationen im Expressionsmedium verhindert. Mit dem resultierenden, leicht anwendbaren Ganzzellsystem wurden dann von 9 Steroiden die Hauptprodukte der CYP260A1 abhängigen Biotransformationen isoliert und mittels NMR-Spektroskopie charakterisiert. Interessanterweise stellte sich heraus, dass es sich bei CYP260A1 um die erste beschriebene 1a-Steroidhydroxylase handelt Somit stellt CYP260A1 einen viel versprechenden Biokatalysator für biotechnolgische Anwendungen dar, mit dem es möglich ist, bislang noch nicht bekannte Steroidderivate herzustellen.

Förderzeitraum:
01.01.2009 - 31.12.2011

Institut:
Universität des Saarlandes
Lehrstuhl für Biochemie

Betreuer:
Prof. Dr. Rita Bernhardt

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URL:

Substratsuche und Produktcharakterisierung von Cytochromen P450 aus Sorangium cellulosum So ce56
Substratsuche und Produktcharakterisierung von Cytochromen P450 aus Sorangium cellulosum So ce56