Entwicklung, Optimierung und Validierung eines Immunoassays zur empfindlichen Bestimmung des endokrinen Disruptors 17alpha-Ethinylöstradiol in Wasser

Stipendiatin/Stipendiat: Dr. Christian Schneider-Thauern

Die Antibabypille in der aquatischen Umwelt ? Arbeiten zur SpurenanalytikVerbindungen wie der Wirkstoff der Antibabypille (Ethinylestradiol) können zu hormonellen Störungen in der Umwelt führen. Bereits sehr kleine Konzentrationen, unterhalb von einem Nanogramm (?ein Milliardstel Gramm?) Ethinylestradiol pro Liter Wasser (ng/L), induzieren eine Verweiblichung männlicher Fische. In die Umwelt gelangt der Wirkstoff durch das kommunale Abwasser. In den Kläranlagen erfolgt meist nur ein unvollständiger Abbau der Verbindung. Typische Konzentrationen im Kläranlagenablauf liegen zwischen 0,1 und 10 Nanogramm pro Liter.Für Untersuchungen dieser Konzentration kommen bislang lediglich apparativ aufwendige massenspektrometrische Verfahren in Frage, wie beispielsweise GC-MS oder HPLC-MS Methoden. Für die routinemäßige Detektion des Ethinylestradiols sind diese auf Chromatographie und Massenspektrometrie basierenden Verfahren nicht geeignet. Sie sind mit vergleichsweise hohem Zeit- und Kostenaufwand verbunden (mindestens ein Arbeitstag pro Probe), zudem müssen die Wasserproben vor der Messung aufkonzentriert werden.Deutlich besser für Routineanwendungen eignen sich Immunoassays. Sie sind mit geringerem Zeit- und Kostenaufwand verbunden und stellen zugleich geringere Anforderungen an die Qualifikation des Personals. Immunassays eröffnen auch die Möglichkeit zur direkten Messung unbehandelter Proben. Die Proben können so ohne Aufkonzentration gemessen werden. Die Grundlage solcher Immunoassays sind Antikörper die spezifisch das Ethinylestradiol binden. Anschaulich ?fischen? die Antikörper den Analyten aus der Wasserprobe. Mit Hilfe einer Farbreaktion kann die Bindung dann gemessen werden.Kern der Promotionsarbeit war es einen möglichst empfindlichen Immunoassay zu entwickeln. Der Assay sollte auch die sehr kleinen Konzentrationen zuverlässig nachweisen können. Hierzu habe ich verschiedene Derivate des Ethinylestradiols synthetisiert und drei neue Immunoassays aufgebaut. Neben der besonderen Empfindlichkeit war es wichtig einen stabilen und selektiven Assay zu entwickeln. Jeder der drei neuen Immunoassays übertrifft bereits die Nachweisgrenzen vergleichbarer Testsysteme. Mit Abschluß der Arbeiten ist es gelungen Konzentrationen unterhalb von einem Nanogramm pro Liter zuverlässig zu messen. Erstmalig ist es nun möglich ohne zusätzliche Aufkonzentration direkt im ökotoxikologisch relevanten Bereich Ethinylestradiol nachzuweisen.Die Praxistauglichkeit der Immunoassays wurde in einer Messkampagne untersucht. Wasserproben wurden hierzu mit den neuen Immunoassays und einer etablierten Referenzmethode gemessen. Das Wasser stammte aus dem Rhein sowie aus zwei seiner kleineren Zuflüsse und aus dem Ablauf verschiedener Kläranlagen. Die Messergebnisse von Immunoassay und Referenz stimmen meist gut überein. In städtisch geprägten Einzugsgebieten liegen die Ergebnisse stets unterhalb von 1 ng/L. In ländliche Regionen sind die Werte leicht erhöht.Die Analytik des Ethinylestradiol ist mit dieser Arbeit nicht nur einfacher und empfindlicher geworden, sie kann auch kostengünstiger durchgeführt werden. Die Verbrauchskosten liegen bei ca. 1,20 ? pro Probe. Der Zeitaufwand für einen Satz von 25 Proben beträgt nur 40 Minuten. Im Vergleich dazu liegen Kosten massenspektrometrischen Verfahren zwischen 100 und 200 ? pro Probe. Die Dissertation und die zugehörigen Veröffentlichungen sind im Internet verfügbar.Volltext der Arbeit: http://www.ub.uni-heidelberg.de/archiv/6012Schneider C., Schöler H.F., Schneider R.J.; 2004, A novel enzyme-linked immunosorbent assay for ethynylestradiol using a long-chain biotinylated EE2 derivative, Steroids, 69, 245-253. http://dx.doi.org/10.1016/j.steroids.2004.01.003Schneider C., Schöler H.F., Schneider R.J.; 2005, Direct sub-ppt detection of the endocrine disruptor ethinylestradiol in water with a chemiluminescence enzyme-linked immunosorbent assay, Analytica Chimica Acta, 551, 92-97. http://dx.doi.org/10.1016/j.aca.2005.07.018

Förderzeitraum:
01.07.2002 - 31.08.2005

Institut:
Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn

Agrikulturchemisches Institut

Betreuer:
Dr. Rudolf J. Schneider

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