Projekt 18506/01

Entwicklung eines umwelt- und gesundheitsfreundlichen Verfahrens zur innovativen Überwachung der Immunsuppressions-Therapie nach Organtransplantation mittels Transplantations-Biochips

Projektträger

Pelikan Technologies GmbH & Co. KG
Nottulner Landweg 90
48161 Münster
Telefon: 02534-8001-26

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Ziel dieses Projekts ist die Entwicklung eines elektrochemischen Transplantations-Biochips, mit dem die immunsuppressive Aktivität der drei am häufigsten verwendeten Immunsuppressiva - Cyclosporin A, FK506 und Rapamycin - und ihrer Metabolite durch Ausbildung des in-vitro Wirkkomplexes (Immunophilin / Immunsuppressivum / Calcineurin bzw. mTOR) bestimmt werden soll. Die Möglichkeit der Bestimmung der immunsuppressiven Aktivität im Gegensatz zur reinen Konzentrationsbestimmung soll die Aussagekraft dieses Rezeptorassays im Vergleich zu den etablierten Analysenmethoden erheblich verbessern und die Steuerung der medikamentösen Therapie nach einer Transplantation vereinfachen. Diese innovative Analysenmethode soll in den Kliniken die gängige HPLC-Methode ersetzen, was zu einer deutlichen Verminderung von Umwelt- und Gesundheitsbelastungen führt. Darüber hinaus soll diese einfach zu handhabende Analysenmethode auch in Arztpraxen bzw. zur Selbstkontrolle beim Patienten Anwendung finden.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDa der Transplantations-Biochip u. a. im Rahmen der Patientenselbstkontrolle zum Einsatz kommen soll, muss er preisgünstig herzustellen sein. Dieses lässt sich mit Hilfe der Siebdrucktechnik realisieren. Auf dem Biochip soll der in-vitro Wirkkomplex nachgebildet werden, wobei die Detektion mittels einer mediatorvermittelten Enzymreaktion unter chronoamperometrischen Bedingungen erfolgen soll. Von daher sollen die Immunophiline mit einem Enzym markiert werden. Dieses wird durch die Herstellung eines Immunophilin-Streptavidin-Fusionsproteins mit anschließender Kopplung eines biotinylierten Enzyms realisiert. Somit finden verschiedene molekularbiologische Arbeitsschritte sowie die Proteinchemie ihren Einsatz. Parallel zur Entwicklung der Rezeptorassays auf dem Biochip ist der Rezeptorassay für FK506 auf der Biacore-Oberfläche aufgebaut worden. Im Falle dieses optischen Biosensors ist die Markierung von Biomolekülen nicht notwendig, die Ausbildung des ternären Komplexes kann online verfolgt werden. Um eine Validierung der neuartigen Rezeptorassays für FK506 sowie für Rapamycin durchführen zu können (für CsA steht sie zur Verfügung), wurde eine HPLC-MS-Methode inkl. Probenvorbereitung mit-tels Festphasenextraktion für diese beiden Immunsuppressiva entwickelt bzw. optimiert. Ebenso wurde eine Probenvorbereitung für das Vermessen der Immunsuppressiva mit dem Biochip entwickelt, die ohne organische Lösungsmittel auskommt.


Ergebnisse und Diskussion

Der ternäre Wirkkomplex, bestehend aus FKBP / FK506 / Calcineurin (Cn) konnte erfolgreich auf der Biacore-Sensoroberfläche aufgebaut werden. Es zeigte sich, dass der Wirkkomplex FKBP / FK506 / Cn stabiler ist als der Wirkkomplex Cyp / CsA / Calcineurin. Es wurde für die Bindung des binären FKBP / FK506-Komplexes an Cn ein KD-Wert von 72 nM und ein koff-Wert von 2,43 x 10-3 s-1 ermittelt; für CsA liegen die Werte bei KD = 177 nM sowie koff = 1,91 x 10-2 s-1. Besonders der um den Faktor 10 kleinerer koff-Wert liefert den entscheidenden Beitrag für die größere Stabilität des FKBP / FK506 / Cn-Komplexes. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der Tatsache, dass die notwendige Konzentration an FK506 in der Phase der Erhaltungstherapie ca. um den Faktor 15 niedriger ist als die Konzentration des CsA. Die rekombinanten Fusionsproteine aus Immunophilin und Streptavidin (Strept) - Cyclophilin-Streptavidin (Cyp-Strept) sowie FKBP-Streptavidin (FKBP-Strept) - sind erfolgreich kloniert und exprimiert worden. Zwecks besserer Aufreinigung wurden alle rekombinanten Proteine mit einem His-Taq versehen. Für die Herstellung der Immunophilin-Enzym-Konjugate wurde folgende Strategie umgesetzt: (I) Herstellung eines re-kombinanten Immunophilin / Strept-Fusionsproteins und (II) Kombination des rekombinanten Fusionsproteins mit biotinylierter Peroxidase (POD) zum fertigen Immunophilin-POD-Konjugat. Durch diese Strategie wird sichergestellt, dass die Immunophiline reproduzierbar modifiziert werden können. Pro 1-Liter Kultur wurden 1,19 mg Strept-FKBP-POD-Biotin sowie 0,56 mg Strept-Cyp-POD-Biotin erhalten. Beide Immunophilin-POD-Konjugate zeigen eine cis-trans-Isomeraseaktivität. Weiterhin konnte mit Hilfe eines Hemmtests gezeigt werden, dass beide Immunophiline (Cyp, FKBP) eine Bindungsaffinität zum jeweiligen Immunsuppressivum (CsA, FK506) aufweisen. Mit Hilfe der Biacore-Methode konnte gezeigt werden, dass die Immunophilin-Konjugate nur in Gegenwart des entsprechenden Immunsuppressivums an Cn binden. Somit beeinträchtigen die angekoppelten Proteine nicht die Ausbildung des ternären Wirkkomplexes. Im Falle des elektrochemischen Biochips mit aufgebrachter Microfilling Technik wurde für das Modellsystem - Avidin/biotinylierter Antikörper/anti-IgG-POD - eine Sensitivität von 0,53 nA/(ng/ml) und eine Nachweisgrenze von 9,45 ng/ml erreicht. Der Nachweis der Immunsuppressiva CsA und FK506 erfolgte mit der Top-Fill Variante des Biochips. Auf der Sensoroberfläche wurde Cn immobilisiert. Zur Bestimmung von CsA bzw. FK506 wurden diese zunächst mit dem entsprechenden Immunophilin-POD-Konjugat gemischt und anschließend auf die Sensoroberfläche gegeben, wodurch sich der ternäre Komplex ausbildete. Das Verhältnis aus Maximalstrom zu Blindwert lag bei CsA bei einem Faktor von ca. 5 und bei FK506 sogar bei einem Faktor von ca. 15. Von CsA und FK506 konnten mit Hilfe des elektro-chemischen Transplantations-Biochips sehr erfolgreich Kalibrierkurven aufgenommen werden. Die Probenvorbereitung für alle Immunsuppressiva sowie der jeweiligen Metabolite ist erarbeitet worden. Die HPLC-MS Methoden zur Bestimmung der Immunsuppressiva CsA, Tacrolimus und Rapamycin wurden sehr erfolgreich optimiert; ein Vergleich mit etablierten Verfahren ergab gute bis sehr gute Übereinstimmung. Da die Rezeptorassays des Transplantations-Biochips auch immunsuppressiv wirkende Metaboli-te der Immunsuppressiva mit erfassen, wurden HPLC-MS-Methoden zur Detektion und Quantifizierung dieser


Verbindungen ebenfalls erfolgreich entwickelt.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

· Teilergebnisse wurden in der DBU-Sonderpublikation mit dem Biotechnologie Nachrichten-Magazin transkript zur Biotechnica 2003 publiziert.
· Das Projekt wurde im Rahmen der Ausstellung Faszination Biotechnologie vorgestellt.
· Ein Paper mit dem Titel Determination of CsA-equivalence values by a receptor assay based on surface plasmon resonance: A correlation to clinical parameters wurde beim International Journal of Clinical Pharmacology and Therapeutics eingereicht.


Fazit

Die rekombinanten Fusionsproteine aus Immunophilin und Streptavidin mit nachfolgender Kopplung der biotinylierten Peroxidase zum fertigen Immunophilin-Enzym-Konjugat wurden erfolgreich hergestellt. Mit der Biacore-Methode konnte gezeigt werden, dass sich die beiden Immunophilin-Enzym / Immunsuppressivum / Calcineurin-Wirkkomplexe auf einer Sensoroberfläche ausbilden; die angekoppelten Proteine beeinträchtigen somit nicht die Ausbildung des in-vivo Wirkkomplexes. Die Immunsuppressiva CsA und Tacrolimus konnten anschließend sehr erfolgreich mit Hilfe des elektrochemischen Transplantations-Biochips unter Einsatz der Immunophilin-Enzym-Konjugate nachgewiesen werden. Parallel dazu wurde der elektrochemische Biochip basierend auf der Microfilling Technik zum Nachweis eines Analyten erfolgreich optimiert. Da im Vollblut die Immunsuppressiva an Membranen und Proteinen gebunden vorliegen, ist eine Extraktionsmethode, die ohne Lösungsmittel auskommt, erarbeitet worden, wodurch Extrakte direkt mit dem Transplantations-Biochip vermessen werden können. Die HPLC-MS-Methoden zur Bestimmung der Immunsuppressiva CsA, Tacrolimus und Rapamycin sowie derer Metabolite wurden sehr erfolgreich optimiert und etabliert. Diese HPLC-MS-Methoden ermöglichen nun eine umfassende Validierung des Transplantations-Biochips.

Übersicht

Fördersumme

490.420,95 €

Förderzeitraum

11.06.2001 - 11.06.2004

Internet

www.inventus-biotec.com

Bundesland

Nordrhein-Westfalen

Schlagwörter

Klimaschutz
Umweltforschung
Umwelttechnik