Projekt 13235/01

Förderschwerpunkt Biotechnologie: ChemBioTec: Entwicklung eines innovativen nachhaltigen Produktionsverfahrens zur Herstellung von Biotensiden in nicht-pathogenen Pseudomonaden (Phase I)

Projektträger

Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Institut für Molekulare Enzymtechnologie am Forschungszentrum Jülich
Stetternicher Forst
52426 Jülich
Telefon: 02461-612947

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Ziel des Gesamtprojektes (Phase 1 und Phase 2) ist die Entwicklung eines nachhaltigen Produktionsverfahrens für Rhamnolipide mit Hilfe eines nicht-pathogenen Bakteriums als Katalysator und umweltscho-nender Produktaufarbeitung. Dabei zielt das Projekt durch Bündelung der Expertisen beginnend bei der Stammkonstruktion, über die Optimierung von Stämmen und Verfahrenstechniken bis hin zum Scale-Up und der Entwicklung alternativer Produktaufarbeitungstechniken direkt auf einen Transfer von Technolo-gie der akademischen Partner hin zu den Industriepartnern ab.
Durch balancierte Expression der relevanten Biosynthese Gene/ Operons aus P. aeruginosa im nicht-pathogenen Stamm P. putida, der sich durch eine hohe Toleranz gegenüber dem Rhamnolipid als Produkt auszeichnet, soll dessen Produktivität gesteigert werden. Hierzu wurde in Kooperation mit der Firma Evocatal ein neues System zur Konstruktion und nachfolgenden Durchmusterung von Bibliotheken synthetischer Promotoren entwickelt. Dieses innovative Promoter-Trap-System basiert auf den neuartigen evoglow Reporterproteinen und wurde bereits genutzt, um eine Promotorbank zu erzeugen, die nunmehr in Kooperation getestet wird. Hierzu wurde die Parallelkultivierung rekombinanter P. putida im BioLector-System erfolgreich etabliert und die Technik genutzt, um die Toleranz der Stämme gegenüber hohen Produkttitern und die Kompatibilität des verwendeten Antibiotikums zu bestätigen. Ferner wurde gezeigt, dass die Schaumbildung keine Limitierung für den Einsatz des Systems darstellt. Somit steht bereits jetzt die notwendige Hochdurchsatzmethodik zur Isolierung geeigneter Promotoren zur Verfügung. Durch Analyse des metabolischen Netzwerks konnte in einem ersten erfolgreichen Schritt das Potential des Stammes für eine metabolische Optimierung gezeigt werden. Hierbei wurde die Rhamnolipidproduktion durch Verwendung einer Mutante des um Vorläufermoleküle konkurrierenden Stoffwechselweges zur Synthese von Polyhydroxyalkanoaten (PHAs) um den Faktor 3,5 gesteigert werden. Ferner wurde eine Entkopplung von Zellwachstum und Rhamnolipidproduktion gezeigt, die eine vereinfachte Optimierung der Leistungsfähigkeit des Wirtsmetabolismus und des genetischen Konstrukts zur Rhamnolipidproduktion erlauben wird. In Up-scaling-Versuchen wurde die rekombinante Produktion von Rhamnolipiden erfolgreich im 50-Liter-Maßstab durchgeführt. Es zeigte sich, dass das gezielte Ausschäumen des Produkts eine Anreicherung um ca. den Faktor 100 erbringen kann, was eine interessante Option zur Verbesserung der Reinigung im Sinne der Umweltfreundlichkeit darstellt. Der Test von Adsorbentien verlief ebenso vielversprechend wie erste Versuche zur Reinigung von Monorhamnolipiden. Die Produktion von Rhamnolipiden war ferner unter Verwendung von Glukose in Mineralmedium möglich. Die technischen Daten für einen Vergleich des bisherigen Prozesses mit den bereits verfügbaren Parametern des hier entwickelten Prozesses unter Gesichtspunkten der Umwelteffizienz wurden bereits gesammelt und kommuniziert - sie werden in einer späteren Projektphase Grundlage einer entsprechenden Analyse in Kooperation mit dem Institut für Umweltinformatik sein.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten Methoden- Optimierung von Expressionsraten durch Entwicklung synthetischer Promotoren in Kombination mit real time PCR, biochemischer Bestimmung der Produktkonzentration und Messung von Reportergenfusionen
- Optimierung der Kulturbedingungen durch Parallelfermentation mit der BioLector-Technologie
- Entwicklung und Vergleich von Reinigungsverfahren; Adsorption und Desorption, Ausschäumung und Kristallisation
- Generierung stabiler Produktionsstämme durch Generierung synthetischer Operonstrukturen und Integration in das Chromosom
- Pilotproduktion von Rhamnolipid


Ergebnisse und Diskussion

Durch ausgewogene (Ko-)Expression der relevanten Biosynthese Gene/Operons aus P.aeruginosa im nicht-pathogenen Stamm P. putida, der sich durch eine hohe Toleranz gegenüber dem Rhamnolipid als Produkt auszeichnet, soll dessen Produktivität gesteigert werden. Hierzu wurde ein neues System zur Konstruktion von Bibliotheken synthetischer Promotoren entwickelt. Die Durchmusterung von ca. 80.000 Klonen ergab Promotor-Konstrukte mit unterschiedlichen Promotorstärken, von denen die besten die Produktion von Rhamnolipiden mehr als vervierfachten. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass sich die Rhamnolipidproduktion bei höheren Temperaturen verbessert. Um diesen Effekt im Detail untersuchen zu können, wurde ein Inkubationsgerät entwickelt, dass die Erzeugung eines Temperaturgradienten über eine Mikrotiterplatte zur Kultivierung von Stämmen und somit ein Temperatur-Screening erlauben wird. Die Parallelkultivierung rekombinanter P. putida im BioLector-System wurde erfolgreich etabliert und die Technik genutzt, um die Toleranz der Stämme gegenüber hohen Produkttitern und die Kompatibilität des verwendeten Antibiotikums zu bestätigen. Ferner wurde gezeigt, dass die Schaumbildung keine Limitierung für den Einsatz des Systems darstellt. Somit steht bereits jetzt die notwendige Hochdurchsatzmethodik zur Isolierung geeigneter Promotoren zur Verfügung. Es wurde erfolgreich eine Produktion bei Kultivierung in Mineralmedium mit Glukose als Kohlenstoffquelle durchgeführt. Zur Optimierung des Mediums wurde eine Design of Experiments-Software etabliert, die in Kombination mit einem automatisierten BioLector-System durchgeführt werden soll. Die rekombinante Produktion von Rhamnolipiden wurde erfolgreich im 50-Liter-Maßstab durchgeführt. Es zeigte sich, dass das gezielte Ausschäu-men des Produkts eine Anreicherung um ca. den Faktor 100 erbringen kann. Der Test von Adsorbentien und entsprechenden Lösungsmitteln verlief ebenso vielversprechend wie erste Versuche zur Reinigung von Monorhamnolipiden. Ebenso wurde eine MPLC-Reinigung etabliert und Rhamnolipidstandards hergestellt. In ersten Anwendungstests wurden Rhamnolipide als vielversprechend im Vergleich zu den etablierten APG-Tensiden für kosmetische Zwecke identifiziert. Parallel wurden Konstrukte hergestellt und erfolgreich getestet, die die rekombinante Produktion von Di-Rhamnolipiden als zweites Produkt er-lauben. Derzeit wird ein erster echter Produktionsstamm konstruiert, der alle bisherig als zielführend identifizierten Merkmale in sich vereint und diese vermittelt durch ein neu etabliertes Transposon-System stabil in seinem Genom integriert tragen wird.
Die technischen Daten für den Vergleich des Benchmark-Prozesses zur Rhamnolipidproduktion und die bereits verfügbaren Parameter des hier entwickelten Prozesses wurden sukzessive gesammelt und kommuniziert - sie sind derzeit in einer entsprechenden Analyse der Umwelteffizienz, die in Kooperation mit dem Institut für Umweltinformatik durchgeführt wird.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Publikationen:
Wittgens A, Tiso T, Arndt TT, Wenk P, Hemmerich J, Müller C, Wichmann R, Küpper B, Zwick M, Wilhelm S, Hausmann R, Syldatk C, Rosenau F and Blank LM (2011). Growth independent rhamno-lipid production from glucose using the non-pathogenic Pseudomonas putida KT2440. Microbial Cell Factories Vol. 10(80)

Poster
Wittgens A, Blank LM, Santiago-Schuebel B, Wilhelm S, Rosenau F (2011). Production of rhamno-lipids in Pseudomonas putida by heterologous expression of rhl-genes from Pseudomonas aeru-ginosa PA01. VAAM, Karlsruhe, Germany

Tiso T, Wittgens A, Arndt TT, Rosenau F, Blank LM (2011).Rhamnolipid Synthesis from Glucose with Engineered Pseudomonas putida .BioTrends, Dortmund, Germany
Santiago-Schübel B, Wittgens A, Wilhelm S, Rosenau F, Hofmann D (2011). Production of rhamno-lipids in Pseudomonas putida. DGMS, Dortmund, Germany
Küpper B, Lesik A, Mause A, del Amor Villa EM, Wichmann R (2011) Isolation and Purification of fermentative produced mono-rhamnolipid BioTrends, Dortmund, Germany
Küpper B, Lesik A, del Amor Villa EM, Wichmann R (2011) Isolation and Purification of Fermenta-tive Produced Mono-Rhamnolipids ECAB, Berlin, Germany

Patente

Means and methods for rhamnolipid production
Foam Adsorption - EP 11 192 918.8


Fazit

Das Projekt Umweltschonende Herstellung und Aufreinigung von Biotensiden (Rhamnolipiden) mit dem nicht-pathogenen Bakterium Pseudomonas putida wurde inhaltlich als Ganzes positiv vorbegutachtet. Aus organisatorischen Gründen wurde seitens der DBU nachträglich eine Unterteilung des Projektes in zwei Phasen vorgeschlagen. Während dieser ersten Phase von Phase 1 haben die Projektpartner bereits entscheidende Resultate erzielt. Diese sind begründet in intensiven Kooperationen innerhalb des Konsortiums und sind durch den exzellent funktionierenden Transfer von Methodik, Materialien und Informationen bedingt. Ebenso konnten erste Publikationen und Patente gemeinsam erfolgreich eingereicht werden, dies teilweise unter Einbindung aller Partner, was wiederum für die besondere Qualität der Gemeinsamkeit spricht. Somit sind die Voraussetzungen für eine erfolgreiche Bearbeitung der gesamten Phase 2 erfüllt, die dann zu dem beabsichtigten und projektierten industriellen Verfahren führen wird.

Übersicht

Fördersumme

262.384,00 €

Förderzeitraum

15.02.2010 - 14.11.2010

Bundesland

Nordrhein-Westfalen

Schlagwörter

Klimaschutz
Ressourcenschonung
Umweltforschung
Umwelttechnik