Projekt 13138/01

Förderschwerpunkt Biotechnologie: ICBio: Biokatalytische Synthese chiraler Gamma-Diole und Gamma-Hydroxyketone

Projektträger

Technische Universität DresdenInstitut für Biochemie
Helmholtzstr. 10
01069 Dresden
Telefon: 0351-463-38355

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

(S,S)-2,5-Hexandiol (HDO) ist ein essentielles chirales Synthon für chirale Übergangsmetallkatalysatoren sowie für die Wirkstoffsynthese. Gegenwärtige Synthesekonzepte leiden durchweg unter einer geringen Atomökonomie. Der derzeit leistungsfähigste, ganzzellbiokatalytische Zugang zur Zielverbindung soll optimiert werden. Dafür muss die partielle Hemmung der Bisreduktion von Acetonylaceton durch das intermediäre Hydroxyketon gelöst werden. Hierzu werden Methoden benötigt, die sowohl das Hydroxyketon als auch das Diol hochselektiv liefern. Es werden enzymatische und mikrobielle Ansätze getestet.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie Biotransformation von Acetonylaceton mit S. cerevisiae soll biochemisch optimiert werden, wobei xenobiotischer Zellstress als Ursache für die bislang beobachtete partielle Inhibierung der mikrobiellen Reduktion untersucht wird. Diese Hemmung betrifft die Reduktion des Zwischenprodukts (S)-2-Hydroxy-5-hexanon (HH) zu HDO.
Erstmals dient xenobiotischer Zellstress als Target für die Optimierung einer Ganzzell-Biotransformation. Ziel ist die Identifikation der zellstressauslösenden Faktoren und der stressinduzierten Enzyme mit Dehydrogenase-Aktivität. Auf Basis dieser Erkenntnisse soll die Ganzzell-Biotransformation durch gezielte Manipulation der Stressphysiologie der Zelle reproduzierbar bei sehr hohen Stereoselektivitäten und hohen Ausbeuten (>90%) gezielt zum HDO bzw. HH geführt werden.
Alternativ zum Ganzzellansatz sollen die an der Reduktion beteiligten Dehydrogenasen und Stressenzyme aus S. cerevisiae isoliert, charakterisiert und kloniert werden, so dass eine rein enzymkatalysierte zellfreie Synthese von HH bzw. HDO möglich ist.
Das neuartige Zellstress-Konzept soll auf die Biotransformation von Diketonen erweitert werden, für die vergleichbare Problematiken existieren. Abschließend werden die isolierten Dehydrogenasen auf ihre Fähigkeit zur in vitro-Biotransformation von Diketonen getestet.


Ergebnisse und Diskussion

Die Ganzzell-Biotransformation von 2,5-Hexandion zu (2S,5S)-Hexandiol wurde optimiert, um das Produkt im industriellen Maßstab kommerziell verfügbar zu machen. Der Zugang zum (2S,5S)-Hexandiol lässt sich über die Ganzzell-Variante mit Saccharomyces cerevisiae realisieren oder in einem wirtschaftlich und, wie die Ökoeffizienzanalyse belegt, ökologisch vorteilhaften Verfahren enzymatisch mit der Alkoholdyhrogenase ADH-T aus Thermoanaerobacter spec. Der optische Antipode ist über die ADH aus Lactobacillus kefir zugänglich. Damit lassen sich das (S,S)- wie das (R,R)-Stereoisomer erstmals gezielt und effizient generieren.
Ferner konnte aus Saccharomyces cerevisiae eine Hexandiolreduktase gereinigt werden. Im GanzzellProzess zeigten sich ausgesprochen vielfältige und komplexe Wechselwirkungen zwischen Edukt 2,5-Hexandion und Ganzzell-Biokatalysator, die einen kommerziellen Einsatz der Ganzzell-Variante nicht zulassen. Dagegen konnte gezeigt werden, dass sich Hefereduktasen eignen, selektiv das intermediäre (2S)-Hydroxy-5-hexanon zu bilden. Damit steht erstmals ein selektiver Zugang zu stereoisomerenreinen Verbindungen dieser Substanzklasse offen.
Ebenfalls sehr erfolgreich ließ sich die Synthese des (2S,5S)-Hexandiols realisieren, indem keine Hefeenzyme, sondern bakterielle Enzyme eingesetzt wurden (s.o). Sie erlauben den vollständigen Umsatz von 2,5-Hexandion in hoher Chemo- und Stereoselektivität. Der Erfolg dieser Variante lag im kontinuierlichen Entfernen des Oxidationsprodukts Aceton aus der Reaktionsmischung, das aus dem zur Cofaktor-Regenerierung verwendeten Isopropanol stammt. Bakterielle Enzyme wurden erforderlich, da allein diese in der Lage sind, sowohl das Dion zu reduzieren als auch Isopropanol zu oxidieren.
Damit wurde das Projekt in jeder Hinsicht sehr erfolgreich durchgeführt. Es existiert eine selektive Synthesemethode für das (2S)-Hydroxy5-hexanon sowie für (2S,5S)-Hexandiol. Die Ergebnisse lassen sich auf andere Dione übertragen, womit das Ziel einer neuen Syntheseplattform für chirale Hydroxyketone und chirale Diole erreicht wurde. Die Ökoeffizienzanalyse zeigt deutlich die Stärken des hier entwickelten Verfahrens auf und belegt dessen ökologische und ökonomische Leistungsfähigkeit verglichen mit dem konventionellen Referenzverfahren.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Stohrer, J., Peschko, C. (2006): Verfahren zur Herstellung von Dihydroxy-Verbindungen aus Diketo-Verbindungen durch enzymkatalysierte enantioselektive Reduktion. Deutsche Patentanmeldung.
Katzberg, M., Wechler, K., Müller, M., Hummel, W., Dünkelmann, P., Stohrer, J., Bertau, M. (2008): Biocatalytical production of (5S)-Hydroxy-2-hexanone. In Vorbereitung.
Katzberg, M., Wechler, K., Müller, M., Daußmann, T., Hummel, W., Bertau, M. (2008): Whole-cell biocatalytic synthesis of -diols and -hydroxy ketones. In Vorbereitung.
Katzberg, M., Wechler, K., Müller, M., Hummel, W., Dünkelmann, P., Stohrer, J., Bertau, M. (2008): A novel diketone reductase from Saccharomyces cerevisiae. In Vorbereitung.
Katzberg, M., Hummel, W., Daußmann, T., Stohrer, J., Bertau, M. (2006): Biokatalytische Synthese von (S,S)-2,5-Hexandiol. Chem. Ing. Tech. 78, 1437.
Auf Einladung der DECHEMA wurden die Ergebnisse dieser Arbeiten vorgestellt:
Bertau, M., Katzberg, M., Hummel, W., Daußmann, T., Stohrer, J. (2006): Biokatalytische Synthese chiraler -Diole und -Hydroxyketone. DECHEMA-Jahrestagung 2006, Wiesbaden, 27.09.2006.


Fazit

Die angestrebte biokatalytische Synthese chiraler Diole und Hydroxyketone konnte erfolgreich realisiert werden. Die generelle Induzierbarkeit von Stressenzymen wurde belegt, gleichzeitig konnte das Anwendungspotenzial für diese Enzyme aufgezeigt werden. Mit ihrer Eigenschaft, Dione selektiv zum Hydroxyketon zu reduzieren, ist die Hefe Saccharomyces cerevisiae ein unverzichtbare Biokatalysator für den kommerziellen Zugang zu dieser Substanzklasse, der als Ergebnis dieses Projekts neu eröffnet wurde.
Mit der Kommerzialisierung der Verfahren wurde begonnen. Im laufenden Jahr sind bereits 20 kg verkauft und weitere 10 kg kundenseitig reserviert worden. Die Ergebnisse der Ökoeffizienzanalyse zeigen unzweifelhaft die ökologische und ökonomische Überlegenheit dieses Verfahrens.
Die Meilensteine wurden fristgerecht erreicht.