Projekt 13094/01

Förderschwerpunkt Biotechnologie: ICBio: Entwicklung von Expressionssystemen für bakterielle Oxidasen und einer Analysetechnologie für die Optimierung industrieller, oxidativer enzymatischer Prozesse

Projektträger

AC Biotec GmbH
Karlheinz-Beckurts-Str. 13
52428 Jülich
Telefon: 02461-690-181

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Im Projekt sollen für drei technisch interessante Oxidasen Expressionssysteme und parallel eine Analy-setechnologie für die Optimierung industrieller, oxidativer enzymatischer Prozesse entwickelt werden. Mit diesen Enzymen (L-Aminosäureoxidase (L-AAO), D-Aminosäureoxidase (D-AAO) und NADH-Oxidase (NOX)) sollen neue Syntheserouten für die Herstellung eines breiten Spektrums an D- und L-Aminosäuren, Ketosäuren, Alkoholen und Ketoverbindungen eröffnet werden. Durch den Einsatz von En-zymen können gerade bei der Synthese chiraler Verbindungen schwermetallhaltige Katalysatoren und aufwändige Aufarbeitungsverfahren vermieden werden. Häufig eröffnen sich durch die Anwendung von Enzymen erst wirtschaftliche Synthesewege für die Herstellung chiraler Substanzen.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenFeinchemikalien und chirale Vorläufermoleküle, die in der pharmazeutischen und chemischen Industrie eingesetzt werden, müssen meist von sehr hoher Enantiomerenreinheit sein. In den letzten Jahren wurden unterschiedliche biokatalytische Systeme zur Produktion chiraler Feinchemikalien auch im industriellen Maßstab etabliert, so dass Substanzen wie Alkohole, Amide und Aminosäuren auch im Tonnenmaßstab enantiomerenrein hergestellt werden können. Der Einsatz von Oxidasen für die Herstellung enanti-omerenreiner Feinchemikalien wurde bisher wenig untersucht, obwohl diese Enzyme hoch stereoselektiv sind. Außerdem ist der Cofaktor (FAD/FMN) fest gebunden, sodass eine externe Zugabe nicht erforder-lich ist. Ebenso ist für Enzyme dieser Gruppe kein zusätzliches Coenzym-Regenerierungssystem erfor-derlich, da reduziertes FADH2 oder FMNH2 durch Sauerstoff reoxidiert wird. Potenziell interessante En-zyme wie L-Aminosäureoxidasen und NADH-Oxidasen können noch nicht in ausreichender Menge her-gestellt werden, um sie für präparative Zwecke einzusetzen. Über genetische Methoden (HHU) und durch Optimierung der Fermentationsbedingungen (ACB) könnte die Verfügbarkeit dieser Oxidasen jedoch auch verbessert werden. Bis heute sind zur Verfolgung enzymatischer Umsetzungen meist aufwändige Probennahmen mit anschließender Analytik (z. B. HPLC) notwendig, um das exakte Ende der Reaktion zu bestimmen. Als eine geeignete Lösung für eine Online-Verfolgung Oxidase-katalysierter Enzymreaktionen könnte sich das Respiration Activity Monitoring System (RAMOS) etablieren (HHU und ACB). Hauptziele des Projekts sind die Entwicklung effizienter Expressionssysteme für verschiedene technisch interessante Oxidasen und die Erforschung und Etablierung der RAMOS-Technologie auf dem Einsatz-gebiet der Enzymtechnologie. Das Projekt soll innerhalb von 2 Jahren durchgeführt werden.


Ergebnisse und Diskussion

Oxidasen:
Für alle Enzyme (NOX aus L. brevis, die D-AAO aus T. variabilis, die D-AAO aus A. protophormiae und die L-AAO aus R. opacus) konnten im Rahmen der Projektbearbeitung leistungsfähige Expressionssys-teme entwickelt werden. Die größten Probleme gab es bei der Entwicklung eines geeigneten Expressi-onssystems für die L-spezifische AAO aus R. opacus, das hängt wahrscheinlich damit zusammen, dass dieses Enzym mit einer TAT-Signalsequenz exprimiert wird. Nach Optimierung auf genetischer Ebene konnten aber zwei gute Expressionssysteme (in Streptomyces lividans und in E. coli) erreicht werden. Die biochemischen Daten der jeweiligen Enzyme, möglichst einschließlich Inhibitorstudien und Strukturdaten stellen die wesentlichen Grundlagen für die Ausarbeitung biokatalytischer Verfahren dar. Die biochemi-schen Daten wurden für alle Enzyme umfassend aufgenommen, zwei Enzyme konnten kristallisiert wer-den. Oxidase-katalysierte Anwendungen konnten für alle Enzyme in kleinem Maßstab umfassend bear-beitet werden. NOX wird für die NADRegenerierung bei der oxidativen Racemattrennung eingesetzt, die-se Verwendung wurde in gekoppelten Ansätzen für die Synthese verschiedener R- und S-Alkohole und für diverse D-Aminosäuren aufgezeigt. In aller Regel werden ee-Werte von 95 bis praktisch 100 % er-reicht. D- und L-Aminosäure-Oxidasen können insbesondere für die Darstellung von L- oder D-Aminosäuren eingesetzt werden; es werden immer enantiomerenreine Produkte erhalten. Im Projekt soll-ten für vier technisch interessante Oxidasen Expressionssysteme entwickelt werden.
Fermentationsoptimierung:
Bei der Tv-DAAO wurde eine Produktionsfermentation (E. coli) durchgeführt, um Material (DAAO) für die
RAMOS-Versuche herzustellen. Diese Fermentation wurde nicht optimiert und spiegelt die Schüttelkol-benergebnisse wider (12U/mL). Bei der Fermentationsoptimierung der Ap-DAAO (E. coli) hat sich her-ausgestellt, dass ein exponentielles Feed-Profil die höchste Aktivität (250U/mL) aufweist. Weiterhin wur-de die Induktorkonzentration optimiert. Bei der Fermentation von Streptomyces lividans wurde im ersten Schritt die Vorkultur optimiert, mit dem Erfolg, dass die gleiche Morphologie im Schüttelkolben wie im Fermenter erreicht wurde. Sowohl in Kolben mit als auch ohne Schikanen. Dies ermöglicht es Medienop-timierung im Schüttelkolben durchzuführen. Fermentationen im 40L Maßstab spiegeln bei der spez. Akti-vität die Ergebnisse des Schüttelkolbens wider. Induktionszeitpunktversuche im Schüttelkolben haben gezeigt, dass eine dreifache Steigerung der spezifischen Aktivität (180mU/mg) möglich ist. Einen durch-schlagender Erfolg stellt aber die Etablierung des Expressionssystems E. coli dar, das vor dem Projekt-beginn als nicht realisierbar galt. Damit konnten die Ausbeuten um einen Faktor 170 gegenüber dem Wildtyp gesteigert werden. Die Hochzelldichtefermentationen der NOX (E. coli System) wurden wie er-wartet erfolgreich durchgeführt.
RAMOS:
Ein Ziel des Projekts war die RAMOS-Technologie in der Enzymtechnologie zu etablieren. Dieses Ziel wurde erreicht. Die Ergebnisse zeigen, dass die RAMOS-Technologie wertvolle Online-Daten liefert, mit deren Hilfe die Enzymstabilität, -aktivität und -inhibierung gemessen werden können, ohne große Pro-benahme und Offline-Analytik-Aufwand. In diesem Projekt wurde nicht nur die Stabilität von Enzymen (D-AAO) bestimmt, sondern auch der Einfluss von anderen Stoffen (wie Wasserstoffperoxid) auf die En-zymaktivität. Weiterhin konnte mit parallelen Ansätzen der Unterschied zwischen löslichen und immobili-sierten Enzym herausgearbeitet werden. Bei der L-AAO konnte mit Hilfe der Online-Technologie eine Sub-stratinhibierung festgestellt werden. Sogar das gekoppelte System des NOX-Systems (Sauerstoff-verbrauch/-produktion in der Enzymregenerierungsreaktion) konnte mit der RAMOS-Technologie ver-messen werden. Dieses Ergebnis erweitert natürlich den Anwendungsbereich dieser Technologie. Die Anwendung der RAMOS-Technologie war in diesem Projekt auf sauerstoffverbrauchende Enzymenreak-tionen beschränkt gewesen. Diese Beschränkung ist aber nicht zwingend notwendig, da fast jede gas-entwickelnde/-verbrauchende Enzymreaktion (z. B. Kohlendioxid) mit dem RAMOS-System vermessen werden können. Der Einsatz dieser Technologie verringert stark die Probenanzahl, die mit Hilfe einer HPLC vermessen werden müssen. Dadurch wird der Gebrauch von Einwegmaterialien und Lösemitteln reduziert. Das Scale-Up der RAMOS-Technologie in den 7,5L Maßstab ist mit herkömmlichen Abgasana-lytiksystemen problemlos realisierbar.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Die Ergebnisse des Projekts wurden auf folgenden Veranstaltungen veröffentlicht:
1) GVC Jahrestagung, München, 2004 2) BioPerspectives, Wiesbaden, 2004, 3) CphI, Brüssel, 2004
4) Biocat, Hamburg, 2004, 5) Bioforum, Lüttich, 2004 6) BioPerspectives, Wiesbaden, 2005

Publikationen:
- W. Hummel, M. Kuzu, B. Geueke (2003): An efficient and selective enzymatic oxidation system for the synthesis of enantiomerically pure D-tert-leucine. Organic Letters 5 (20):3649-50.
- W. Hummel, M. Kuzu, B. Geueke (2004): Oxidative resolution of racemic mixtures by the coupled use of dehydrogenases and NADH oxidase. Appl. Microbiol. Biotechnol. (in press).
- M. Kuzu, W. Hummel (2004): Preparation of D-amino acids by enantioselective oxidation catalyzed by recombinant Escherichia coli cells expressing L-leucine dehydrogenase and NADH oxidase. ChemBi-oChem (submitted).
- M. Kuzu, K. Niefind, W. Hummel, D. Schomburg (2005): Crystallization and preliminary crystallo-graphic analysis of a flavoprotein NADH oxidase from Lactobacillus brevis. Acta Crystallographica Sec-tion F 61: 528-30.
- M. Kuzu, W. Hummel (2005): Influence of the expression conditions on the formation of apo- and holoenzyme from Lactobacillus brevis NADH oxidase. Biochimica et Biophysica Acta (submitted).
- Z. Findrik, D. Vasi_-Ra_ki, M. Kuzu, W. Hummel (2005): Application of a new D-amino acid oxi-dase from Arthrobacter protophormiae. Engineering in Life Sciences (submitted).
- M. Kuzu, K. Niefind, W. Hummel, D. Schomburg (2005): S


Fazit

Im Projekt sollten für vier technisch interessante Oxidasen Expressionssysteme entwickelt werden. Die NOX aus L. brevis, die D-AAO aus T. variabilis, die D-AAO aus A. protophormiae und die L-AAO aus R. opacus wurden erfolgreich kloniert und heterolog exprimiert. In allen Expressionsstämmen konnte eine hohe Proteinexpression erzielt werden. Weiterhin konnte die RAMOS-Technologie erfolgreich in der En-zymtechnologie (Oxidasen) als Alternative zur HPLC-Analytik etabliert werden. Der Einsatz der RAMOS-Technologie reduziert den Einsatz von Lösungsmitteln und Einwegmaterialen, die bei der HPLC-Technologie benötigt werden.