Projekt 13088/01

Förderschwerpunkt Biotechnologie: ICBio: Glyoxylat-Produktion auf Zuckerbasis

Projektträger

Forschungszentrum Jülich GmbH Institut für Biotechnologie 1
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52425 Jülich
Telefon: 02461-61-3294

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Glyoxylsäure, OHC-COOH, ist ein hochinteressanter Ausgangsstoff für die Synthese verschiedener heterocyclischer Verbindungen, Antibiotika, Polyacrylamide, Benzaldehyde und pharmazeutischer Bausteine. Die Herstellung von Glyoxylsäure erfolgt bisher chemisch durch Oxidation von Glyoxal mit Salpetersäure. Dieses Verfahren ist energieintensiv und führt aufgrund der Bildung von Oxalsäure zu einer schlechten Ausbeute. Obwohl Glyoxylat ein zentrales Stoffwechselintermediat in vielen Organismen darstellt, wurden unseres Wissens nach bisher keine Forschungsarbeiten zur biotechnologischen Produktion von Glyoxylat aus Zuckern publiziert. Das Ziel des geplanten Projekts ist die Entwicklung eines neuen, nachhaltigen und umweltschonenden Verfahrens zur Herstellung von Glyoxylat aus Zucker mit Hilfe von rekombinanten Bakterien-Stämmen (Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum) inklusive der dazugehörigen Produktaufarbeitungstechnik und zwar bis in den Technikumsmaßstab.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDas vorgestellte Gemeinschaftsprojekt von IBT-1, IBT-2 und der bitop AG zielt darauf ab, alternativ zur bisherigen chemischen Produktion des ‚bulk-Produkts Glyoxylat aus (chemisch hergestelltem) Glyoxal ein biotechnologisches Verfahren zur Glyoxylat-Produktion aus dem nachwachsenden Rohstoff Glucose zu etablieren, das einen signifikanten Beitrag zur Umweltentlastung leistet und ökonomisch konkurrenzfähig ist. Das Projekt besteht aus drei Teilprojekten:
· Konstruktion und Charakterisierung von bakteriellen Glyoxylat-Produktionsstämmen basierend auf E. coli oder C. glutamicum (IBT-1, Prof. M. Bott)
· Entwicklung eines mikrobiellen Produktionsprozesses inklusive der dazugehörigen Produktaufarbeitung und Stoffwechselquantifizierung (IBT-2, Dr. R. Takors)
· Übertragung der Labor- und Pilotergebnisse in den technischen Maßstab und beginnende Vermark-tung des Produkts Glyoxylat (bitop AG, Dr. T. Schwarz)


Ergebnisse und Diskussion

Ziel des vorliegenden Projekts war die Entwicklung eines biotechnologischen Verfahrens zur Herstellung des bulk-Produkts Glyoxylat aus Glucose mit Hilfe von rekombinanten Bakterienstämmen, die Glyoxylat mittels der Isocitratlyase bilden, aber nicht weiter umsetzen können. Aufgrund einer hohen Resistenz ge-genüber extern zugegebenem Glyoxylat wurde Escherichia coli als geeigneter Stamm ausgewählt. Nach vergeblichen Versuchen mit dem Stamm MG1655 konnten in dem nahe verwandten Stamm W3110 sukzessive die Gene für Malat-Synthase G (glcB), Isocitrat-Dehydrogenase (icd), Malat-Synthase A (aceB) und Glyoxylat-Carboligase (gcl) deletiert werden. Die resultierenden Mutanten wurden D1, D2, D3 und D4 genannt. Die drei letztgenannten Stämme sind aufgrund der icd-Deletion glutamat-auxotroph. Der W3110D4-Stamm kann nicht mehr auf Glyoxylat als einziger Kohlenstoffquelle wachsen. Um die Isocitratlyase überzuproduzieren, wurden die aceA-Gene von Corynebacterium glutamicum und E. coli in verschiedene Vektoren kloniert und die resultierenden Plasmide in den Stamm W3110D4 transferiert.
Die Kultivierung der Stämme W3110D3 und W3110D4 mit bzw. ohne aceA-Expressionsplasmide in Schüttelkolben sowie im Fermenter führte in allen Fällen zu ähnlichen Resultaten: die Stämme bildeten in erster Linie Acetat, Pyruvat und Lactat, aber kein Glyoxylat. Auch die Supplementation mit Citrat, Succinat, Malat oder Aspartat führte nicht zu einer Glyoxylat-Bildung. Neben Versuchen mit wachsenden Zel-len wurde eine Vielzahl von Experimenten mit ruhenden Zellen durchgeführt, wobei als Substrate neben Glucose auch Acetat, Citrat, Succinat und Malat getestet wurden. Auch bei diesen Biotransformationen wurden in erster Linie Acetat, Pyruvat und Lactat gebildet, aber kein Glyoxylat. Um auszuschließen, dass ein fehlender Export die Ursache für das Ausbleiben der Glyoxylat-Bildung darstellt, wurden Versuche mit Triton X-100 behandelten Zellen durchgeführt. Diese zeigten eine 90 %ige Reduktion der Glucose-Verbrauchsrate, aber keine Glyoxylat-Bildung.
Zur Aufarbeitung von Glyoxylat aus dem Fermentationsmedium wurden zwei Verfahren getestet, die Re-aktiv-Extraktion mit Zentrifugalextraktoren sowie die Elektrodialyse. Bei der Reaktivextraktion wurde eine 30 %ige Lösung von Trioctylmethylammoniumchlorid in Octanol als geeignete Lösungsmittelphase identifiziert sowie eine 10 %ige NaCl-Lösung als geeignete Akzeptorphase. Unter den getesteten Bedingungen konnte innerhalb von 6 h eine Donorphase mit 10 g/l Glyoxylat auf unter 2 g/l abgereichert werden mit einem Gesamtextraktionsgrad von 64 %. Bei der Elektrodialyse wurde eine Modelllösung (E. coli-Fermentationslösung mit zugesetztem Na-Glyoxylat) zunächst über einen selektiven Ionenaustauscher von mehrwertigen Kationen befreit und anschließend in die Elektrodialyse eingesetzt. Mit homopolaren Membranen konnte Na-Glyoxylat mit einem Faktor von 2.8 angereichert werden. Bei der anionischen bi-polaren Elektrodialyse konnte Na-Glyoxylat mit einer Konversionsrate von >95 % in Glyoxylsäure überführt und um mehr als den Faktor 4 angereichert werden.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die geplanten Stammkonstruktionen zwar erfolgreich durchgeführt werden konnten, die erhaltenen Stämme aber nicht die gewünschte Umsetzung von Glucose zu Glyoxylat katalysieren. Es scheint eine Blockade beim Eintritt in den Citrat-Zyklus zu geben, die da-zu führt, dass das im Zuge der Glykolyse gebildete Acetyl-CoA größtenteils in Acetat umgesetzt wird. Möglicherweise tolerieren die Zellen nur sehr geringe intrazelluläre Konzentrationen von Glyoxylat und besitzen einen Schutzmechanismus, der beim Erreichen einer bestimmten Schwellenkonzentration die weitere Bildung von intrazellulärem Glyoxylat durch die Isocitratlyase verhindert.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Das Projekt und die erzielten Ergebnisse wurde im Rahmen der IC-Bio-Verbundtreffen vorgestellt. Aufgrund der Tatsache, dass das Hauptprojektziel nicht erreicht wurde, wurde auf eine Präsentation der Daten im Rahmen von Tagungen verzichtet.


Fazit

Obwohl die geplanten metabolic engineering-Arbeiten mit Escherichia coli erfolgreich durchgeführt werden konnten, katalysierten die erhaltenen Stämme nicht die gewünschte Umsetzung von Glucose zu Glyoxylat. Die Ursache dafür konnte nicht identifiziert werden. Hinsichtlich der Aufarbeitung von Glyoxylat aus wässriger Lösung konnten zwei alternative Verfahren etabliert werden, die Reaktivextraktion und die Elektrodialyse. Da ein erfolgreicher Abschluss des Projekts innerhalb des von der DBU gesetzten Zeit-rahmens von zwei Jahren nicht absehbar war, wurde das Projekt nach 18 Monaten Laufzeit beendet.