Projekt 13055/01

Förderschwerpunkt Biotechnologie: Substitution umweltbelastender chemischer Synthesen zur Herstellung von Ambrariechstoffen durch Entwicklung eines nachhaltigen biotechnologischen Verfahrens – Erarbeitung der molekularbiologischen und biotechnologischen

Projektträger

Vita 34 AGGeschäftsbereich BioPlanta
Perlickstr. 5
04103 Leipzig
Telefon: 0341-22458-33

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Ambrariechstoffe besitzen in der Geruchsstoffherstellung eine große Bedeutung. Gegenwärtig wird der Ambrariechstoff Ambroxan in einer dreistufigen Synthese aus dem von Muskateller Salbei (Salvia scla-rea) gebildeten Sclareol gewonnen. Diese Synthese ist jedoch sehr energieaufwändig und erfordert den Einsatz umweltbelastender Chemikalien. Das Marktvolumen von Ambroxan liegt zurzeit mittelwertig bei 20 Tonnen pro Jahr. Hierfür ist eine Ausgangsbasis von ca. 33 Tonnen Sclareol pro Jahr notwendig. Für die Produktion einer Tonne Ambroxan werden 207 Tonnen verschiedener Einzelstoffe benötigt, die wiederum den Anfall von 206 Tonnen Abfall bedingen. Die anfallenden Substanzen weisen unterschiedliche, insgesamt aber verhältnismäßig starke Umwelt- und Gesundheitswirkungen auf. Im Rahmen dieses Projekts sollten die Grundlagen für die umweltschonende Produktion von Ambrariechstoffen erarbeitet werden. Durch den Einsatz biotechnischer Verfahren soll das Entstehen von Umweltgiften vermieden und der Energieaufwand drastisch reduziert werden. Im Gegensatz zum Feldanbau gewährleistet eine in vitro Kultivierung des Muskateller Salbeis eine gleichbleibend hohe Qualität der produzierten pflanzlichen Biomasse ohne den Einsatz von Pflanzenschutzmitteln. Es sollte daher demonstriert werden, dass in vitro Kulturen von Muskateller Salbei geeignet sind, Sclareol für eine mikrobielle Umsetzung zu produzieren. Es war zu überprüfen, inwieweit sich mit molekularbiologischen Methoden der Wirkstoffgehalt in Muskateller Salbei aber auch in Tabak und Hefen weiter optimieren lässt. Es waren Aussagen zur Verfahrens-grundlage zu erarbeiten, Lösungswege für eine weitere Optimierung und Umsetzung des Verfahrens auf-zuzeigen.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenEntsprechend der Zielsetzung gliederte sich das Vorhaben in zwei Teilprojekte. In der BioPlanta GmbH wurde eine Machbarkeitsstudie zur in vitro Kultivierung von Pflanzen, Organen und Zellsuspensionen für die Gewinnung von Sclareol durchgeführt. Ausgehend vom Saatgut wurden in vitro Kulturen von Muskateller Salbei angelegt. Anhand von Untersuchungen zur Kultivierung von Muskateller Salbei in Temporary Immersion Systemen bezüglich Wachstum und Wirkstoffgehalt der geernteten Pflanzen wurden Möglichkeiten einer wirtschaftlichen Produktion im technischen Maßstab abgeschätzt. Das Teilprojekt des Instituts für Pflanzenbiochemie beinhaltete eine Machbarkeitsstudie zur gentechnischen Optimierung der Sclareol-Biosynthese. Dazu wurden Ansätze zur Isolierung der Sclareol-Biosynthesegene aus Muskateller Salbei verfolgt, um diese in transgenem Muskateller Salbei überzuexprimieren oder in andere Organismen, wie z. B. Hefe oder Tabak, zu übertragen.


Ergebnisse und Diskussion

Die Inkulturnahme von Salvia sclarea durch Sterilaussaat gestaltete sich zunächst aufgrund der sehr geringen Keimrate als schwierig. Durch Einsatz von Gibberellinsäure und Keimung im Dunkeln konnte die Keimrate jedoch deutlich erhöht werden (je nach Genotyp auf 30-44 %). Einer dieser beiden Faktoren al-lein war nicht wirksam. Dies zeigt, dass die Keimung unter Standardbedingungen (d. h. Medium ohne Hormonzusatz, Kultur im Licht) durch zwei unabhängige Systeme gehemmt war. Daher wurde aus den vorliegenden Versuchen als Standardprotokoll für die Sterilaussaat von Salvia sclarea die Keimung im Dunkeln auf MS-Medium mit Zusatz von 0,5 mg/l Gibberellinsäure abgeleitet.
Die Vermehrung der Biomasse konnte erfolgreich auf das Bioreaktorsystem übertragen werden. Durch Verwendung unterschiedlicher Modulgrößen konnten Wachstumsraten bis zum Faktor 27 innerhalb von 61 Tagen erreicht werden. Durch die dargestellten Ergebnisse konnte gezeigt werden, dass eine in vitro Biomasseproduktion von Salvia sclarea im Bioreaktor möglich ist.
Zur Bestimmung des Gehalts an Sclareol in den Drüsenhaaren des Muskateller Salbei aus in vitro Kultur wurden zunächst verschiedene Analyseverfahren miteinander verglichen. Hierbei zeigte sich die HPLC mit UV/VIS-Detektion als ungeeignet für die Sclareol-Analytik. Es wurde sowohl eine DC-Methode zum Sclareol-Nachweis erarbeitet, als auch ein Extraktionsverfahren entwickelt, welches eine GC-MS-Analytik möglich machte. Letzteres erwies sich als sehr empfindliche und genaue Methode zum Sclareol-Nachweis.
Mit den etablierten Analyseverfahren konnte Sclareol in den Drüsenzellen von Pflanzen aus dem Feldanbau nachgewiesen werden, nicht jedoch in den Blättern der untersuchten in vitro Pflanzen. Die Konzentration von Sclareol ist in den Drüsenhaaren der untersuchten Blätter mit 0,02 % der Frischmasse sehr gering im Vergleich zu den Blütenorganen. Jedoch kann dadurch abgeleitet werden, dass die auf den Blättern befindlichen Drüsenhaare grundsätzlich für eine Sclareol-Biosynthese geeignet erscheinen. Im Rahmen dieser Arbeiten konnte ferner gezeigt werden, dass die bei Feldpflanzen auf den Blättern vorkommenden Drüsenhaartypen auch bei den in vitro gewachsenen Sprossen vorhanden sind.
Aus der isolierten poly (A)+ RNA der blütenständigen Drüsenhaare wurde eine cDNA Bibliothek erstellt. Es wurden etwa 1000 EST-Klone sequenziert. Die durchschnittliche Länge der Klone betrug 410 Basen-paare (bp). In einem Sequenzvergleich mit EST-Sequenzdatenbanken wurden 54 ESTs identifiziert, die eine Homologie zu Genen der Terpen-Biosynthese besitzen. Zwölf Klone hatten eine Homologie zu Ge-nen der Diterpensynthase und sieben Klone zum Cytochrom 450s. Ein cDNA-Klon mit einer Länge von 300 bp wurde mittels RACE-PCR zu einem vollständigen cDNA-Klon verlängert, der im Sequenzvergleich eine Homologie zur Copal-Diphosphat-Synthase aus der Tomate Lycoperesicon ssp. besitzt.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Im Rahmen des 10. Internationalen Kongresses für nachwachsende Rohstoffe und Pflanzenbiotechnologie NAROSSA 2004 (7.-8. Juni 2004 in Magdeburg) und des Kongresses Bioperspectives 2004 (4.-6. Mai in Wiesbaden) wurden Präsentationen angemeldet, in denen das Projekt und die erzielten Ergebnisse vorgestellt werden sollen. Die Projektergebnisse sind zur weiteren Veröffentlichung in Fachzeitschriften und bei Kongressen vorgesehen.


Fazit

Die biotechnologische Produktion von Ambrariechstoffen wird unter Anwendung molekularbiologischer Ansätze als Erfolg versprechend angesehen. Die Isolierung eines ersten full length clones der Sclareol-Biosynthese-Gene bildet die Voraussetzung für eine gezielte gentechnische Veränderung von Pflanzen zur wirtschaftlichen Produktion von Sclareol. EST-Klone mit Homologien zu den übrigen Biosynthese-Genen liegen in der drüsenhaarspezifischen cDNA-Bibliothek vor. Durch weiterführende Arbeiten ist eine vollständige Klonierung der Sclareol-Biosynthese zu erwarten. Eine in vitro Produktion von Sclareol in transgenen Pflanzen ermöglicht die anschließende mikrobielle Umsetzung zu Ambrariechstoffen. Hierdurch könnte die umweltbelastende chemische Synthese von Ambroxan aus Sclareol nachhaltig durch ein umweltschonenderes biotechnologisches Verfahren ersetzt werden.

Übersicht

Fördersumme

124.966,00 €

Förderzeitraum

01.07.2002 - 30.09.2003

Internet

www.bioplanta-leipzig.de

Bundesland

Sachsen

Schlagwörter

Klimaschutz
Umweltforschung
Umwelttechnik