Projekt 13040/03

Förderschwerpunkt Biotechnologie: Verbund Industrielle Nutzung von Biokatalysatoren: Entwicklung innovativer biotechnologischer Verfahren zur mikrobiellen Reduktion von Ketoverbindungen

Projektträger

Forschungszentrum Jülich GmbHInstitut für Biotechnologie 2
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52425 Jülich
Telefon: 02461/61-3955

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Am Beispiel der Reduktion prochiraler Ketone sollen Ganzzell-Verfahren entwickelt werden, um die Darstellung enantiomerreiner Alkohole bis in den technischen Maßstab zu erreichen. Dazu sollen die Eigenschaften der Mikroorganismen zur Durchführung der Hydrierreaktion durch gentechnische Methoden verbessert werden (z. B. durch Coexpression von Reduktase und einem geeigneten Coenzym-regenerierendem Enzym). Als Cosubstrate sollen verschiedene gut metabolisierbare Verbindungen wie Glucose oder Formiat vergleichend geprüft werden. Rekombinante Produktionsstämme werden im Schüttelkolbenmaßstab charakterisiert und der mikrobielle Produktionsprozess im Labormaßstab opti-miert.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenUnter Verwendung rekombinanter E. coli-Zellen sollen enantioselektive Reduktionen mit ganzen Zellen realisiert werden. Dabei soll neben der gewünschten Reduktase ein System zur Coenzym-Regenerierung in E. coli co-exprimiert werden. Nach Entwicklung neuartiger Syntheserouten werden prochirale Ketone für die enantioselektive Reduktion bereitgestellt und die Ganzzell-Umsetzung mit einem biologischen System charakterisiert und kinetisch quantifiziert. Es sollen neuartige Methoden und Apparate entwickelt werden, um eine effiziente Kinetikbestimmung zu erreichen. Die Daten der Kinetikbestimmung können als Grundlage für eine anlagen- und prozesstechnische Entwicklung des fermentativen Verfahrens dienen. Unter Verwendung einer dispersen Substratzufuhr soll ein scale-up-fähiger Fermentationsprozess im Labormaßstab entwickelt werden.


Ergebnisse und Diskussion

Im Mittelpunkt der 5 Teilprojekte zur Biohydrierung steht die Reduktion von 3,5-Dioxohexansäuretert-butylester (bzw. 4-Cl-Acetophenon als Referenzedukt) zu 5-Hydroxy-3-oxo-hexansäurederivaten mit Hil-fe geeigneter mikrobieller Systeme bis in den technischen Maßstab. Im Rahmen der Stammkonstruktion wurde ein Produktionssystem entwickelt, das die Gene der Alkoholdehydrogenase (ADH) aus Lactoba-cillus sp. zusammen mit einer heterolog aus B. subtilis stammenden Glucosedehydrogenase (GDH) plasmid-codiert zur künstlichen NADPH-Regenerierung co-exprimiert. Entsprechende Ganzzellsysteme wurden hinsichtlich der Genanordnung auf dem Plasmid optimiert und vergleichend getestet. Ein Ganzzellsystem wurde in wässrig-organischen Lösungsmitteln eingesetzt und quantitativ bewertet. Im Teilprojekt Bioorganische Chemie gelang die durch umfangreiche Publikationen belegte regio- und enantioselektive Reduktion von 3,5-Di-ketohexansäureestern zu nunmehr allen vier diastereomeren Diolen bis in den 100 g Maßstab. Daneben wurden entsprechende Analysetechniken (GC-MS, HPLC und NMR) entwickelt und den Projektpartnern zur Verfügung gestellt. Mehrere Methoden zur modellgestützten Fed-Batch Versuchsplanung wurden im Teilprojekt Makrokinetik in die MATLAB/SIMULINK Umgebung implementiert und experimentell validiert. Die sequenzielle Überprüfung der Versuchsplanungstechniken konnte erfolgreich anhand eines L-Valin produzierenden C. glutamicum-Stamms durchgeführt werden. Dieser Stamm wurde eingesetzt, da zum Zeitpunkt der experimentellen Überprüfung noch kein geeignetes E. coli-Biotransformationssystem mit Cofaktorregenerierung einsetzbar war. Im Teilprojekt Verfahrenstechnik konnte mit dispersiver Bereitstellung des schlecht wasserlöslichen 6?Cl-3,5-Dioxohexansäure-tert-butylester im Rührkesselreaktor mit ruhenden Lactobacillus kefir Zellen die Raum-Zeit-Ausbeute um den Faktor 10 auf bis zu 7.5 mmol L-1 h-1 (3R,5S)-Dihydroxyhexanoat bei ei-nem Enantiomerenüberschuss von über 99 % und einer Ausbeute von 55% gesteigert werden. Für das Referenzedukt 4-Cl-Acetophenon konnte durch Einsatz von Isopropanol und Glukose als Cosubstrat und intermittierender Edukt-Zudosierung die spezifische Produktbildung bei der asymmetrischen Reduk-tion um den Faktor 2.5 auf 6.3 mmol g-1 L. kefir gesteigert werden. Über den Einsatz der 3-dimensionalen optischen Laser-Rückreflexionsmessung (3-D-ORM) zur Bestimmung von Tropfengrößen und -verteilungen in Kombination mit einer offline Bildanalyse konnten mittlere Tropfendurchmesser für beide Edukte bestimmt werden. Die ermittelten Tropfendurchmesser zeigen, dass für die untersuchten Biotransformationen eine ausreichende Stoffaustauschfläche zur Verfügung gestellt werden kann, so dass keine Stofftransportlimitierung auftritt. Bedingt durch eine strikte Umorientierung zukünftiger Geschäftsbereiche bei dem ehemaligen Kooperationspartner Rhein Biotech GmbH, schied die Firma im Jahr 2002 aus dem laufenden Projekt aus, weshalb im Anschluss die Firma Jülich Fine Chemicals, JFC, deren Rechte und Pflichten für die Projektrestlaufzeit übernahm.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

- M. Wolberg, A.G. Ji, W. Hummel, M. Müller, Synthesis, 2001(6): p. 937-942.
- M. Wolberg, I. A. Kaluzna, M. Müller, J. Stewart, Bakers yeast reduction of tert-butyl 6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoate, Tetrahedron: Asymmetry 2004, 15, (submitted).
- M. Wolberg, W. Hummel, M. Müller, Chem. Eur. J., 2001. 7(21): p. 4562-4571.
- M.A. Brik Ternbach, C. Wandrey, R. Takors (2003) Application of Experimental Designs for Modelling of a Fermentative L-Valine Production Process by Corynebacterium glutamicum, 4th International Symposium on Mathematical Modelling (MATHMOD 4), Wien, 05.-07.02.
- M.A. Brik Ternbach, C. Wandrey, R. Takors (2003) Model Based Process Development of a Fermentative L-Valine Production Process Using Corynebacterium glutamicum, 21 DECHEMA-Jahrestagung der Biotechnologen, Garching, 02.-04.04.
- M. Müller, R. Takors, W. Hummel, M. Amidjojo, D. Weuster-Botz, C. Wandrey, Poster biocat 2002; 28.7.2002-31.7.2002, Hamburg, 2002.
- Weckbecker, W. Hummel, M. Amidjojo, D. Weuster-Botz, M. Brik Ternbach, R. Takors, M. Müller, C. Wandrey, Transkript; Sonderheft Nachhaltige Biokatalyse, 2003, S. 100-104, 2003


Fazit

Durch die gemeinsame Bearbeitung des Projekts von Seiten der Organischen Chemie (Vorstufen-Synthese), der Mikrobiologie/Genetik (Stammkonstruktion) und der Verfahrenstechnik (Verfahrenstechnische und Makrokinetische Bearbeitung) konnte beispielhaft gezeigt werden, dass es möglich ist, mit einem umwelt- und ressourcenschonenden biologischen Verfahren eine stereo- und regioselektive Reduktionsreaktion (Synthese von 3,5-Dihydroxyhexansäurederivaten) in den technischen Maßstab zu überführen und dabei auf üblicherweise eingesetzte schwermetallhaltige Katalysatoren zu verzichten.
Wirtschaftliche Verwertung der Projektergebnisse
Die Firma JFC - Jülich Fine Chemicals GmbH hat in der Zwischenzeit die im Institut für Biotechnologie bei Herrn Dr. M. Müller entwickelte Substratsynthese in den >100 g-Maßstab übertragen und insgesamt zweimal erfolgreich durchgeführt, um einen ersten Auftrag über 25 g des tert-Butyl (S)-6-chlor-5-hydroxy-3-oxohexanoat zu erfüllen. Weitere Produktaufträge in diesem Umfeld werden erwartet.
Weitere potenzielle Nutzer oder Kapitalgeber
Zur Indikation möglicher Produkt-Nutzer ist die nachfolgende Publikationsliste zum Thema Verwendung des tert-Butyl (S)-6-chlor-5-hydroxy-3-oxohexanoat (und des entsprechenden (R)-Enantiomers) in der Wirkstoff- und Naturstoffsynthese angegeben:
- A. Job, M. Wolberg, M. Müller, D. Enders, Asymmetric Synthesis of S-(+)-Argentilactone and S-(-)-Goniothalamin, Synlett 2001, 1796-1798.
- J. L. Vicario, A. Job, M. Wolberg, M. Müller, D. Enders, Asymmetric Total Synthesis of (-)-Callystatin A Employing the SAMP/RAMP Hydrazone Alkylation Methodology, Org. Lett. 2002, 4, 1023-1026.
- D. Enders, J. L. Vicario, A. Job, M. Wolberg, M. Müller, Asymmetric Total Synthesis of (-)-Callystatin A and (-)-20-epi-Callystatin A Employing the SAMP/RAMP Hydrazone Alkylation Methodology, Chem. Eur. J. 2002, 8, 4272-4284.
- D. Enders, A. Lenzen, M. Müller, Efficient Asymmetric Syntheses of (+)-Strictifolione, Synthesis 2004, 1486-1488
Weiterführende EntwicklungsmöglichkeitenNeben den bereits genannten Themen sind folgende Entwicklungsmöglichkeiten zu nennen:
· Die Übertragung der Optimierung der LBADH-katalysierten Reduktion des tert-Butyl 6-chlor-3,5-dioxohexanoats kann auch zur des tert-Butyl (R)-6-chlor-5-hydroxy-3-oxohexanoat mit isolierter ADH aus Bäckerhefe genutzt werden und erlaubt den Zugang zu den vier möglichen stereoisomeren 3,5-dihydroxyestern in enantiomerenreiner Form und in präparativen Mengen. Diese können wiederum in vielfältiger Form in der Synthese von Polyketid-abgeleiteten Natur- und Wirkstoffen genutzt werden.
· Die modelldiskriminierende Versuchsplanungstechnik ist in einer Software Matlab/Simulink verfügbar und steht für entsprechende Anwendungen bereit