Projekt 13028/20

Förderschwerpunkt Biotechnologie: Verbund Sensorik in der Biotechnologie Entwicklung einer umweltfreundlichen innovativen Analysemethode zur Konzentrationsbestimmung von Cyclosporin A und seiner Metabolite

Projektträger

Pelikan Technologies GmbH & Co. KG
Nottulner Landweg 90
48161 Münster
Telefon: 02534-8001-26

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Cyclosporin A (CsA) stellt heutzutage das Medikament erster Wahl zur therapeutisch induzierten Immunsuppression in der Transplantationsmedizin dar. Der Einsatz von CsA bedarf jedoch einer strengen Kontrolle, da das therapeutische Fenster der Dosierung relativ schmal ist. Um die Aussagekraft der CsA-Analytik zu verbessern, wird heute diskutiert, im Gegensatz zur Bestimmung der Pharmakokinetik die Pharmakodynamik eines Medikamentes zu bestimmen. Durch die veränderte Analytik soll eine Optimierung der Dosierung des Medikamentes erleichtert werden. Ziel dieses Projektes war die Verbesserung der medizinischen Betreuung von Transplantationspatienten durch Entwicklung einer wirkungsbezogenen und umweltfreundlichen Analysenmethode für CsA. Mit dem zu entwickelnden Rezeptorassay, bei dem eine Bindung von CsA-Metaboliten an die physiologischen Rezeptorproteine (Calcineurin, Cyclophilin A) und damit eine vorhandene immunsuppressive Wirkung von CsA-Metaboliten miterfaßt wird, wurde die Möglichkeit der Bestimmung der biologischen Aktivität des Medikamentes CsA aufgegriffen. Durch Nachweis und Quantifizierung der Ausbildung des ternären in vivo-Wirkkomplexes aus Calcineurin, Cyclophilin A und CsA bzw. CsA-Metaboliten im Gemisch soll ein Wert für die immunsuppressive Aktivität einer Probe bestimmt werden. Entsprechend der Forderung des Ausschreibungstextes des Schwerpunktes Biomedizintechnik kann durch die innovative Bestimmung der Wirkung des Medikamentes aus dem Blut eines Patienten die Funktionsfähigkeit implantierter Transplantate überwacht, geschützt und die intensivmedizinische Betreuung des Patienten erleichtert werden. Zudem kommt die neue Analytik nahezu ohne die Verwendung von organischen Lösungsmitteln aus, so daß sie im Bereich Ressourcenschonung und Umweltschutz der bisher in vielen Fällen unersetzlichen HPLC-Analytik deutlich überlegen ist.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie Vorbereitung der Blutproben wurde für die Biacore-Analysenmethode optimiert, die Verwendung von organischen Lösungsmitteln soweit wie möglich minimiert. Die Messung selbst erfolgt grundsätzlich im wäßrigen Puffersystem, so daß die große Menge an organisch-wäßrigem Abfall, die bei der HPLC anfällt, vermieden wird. Die mit der Biacore-Methode für verschiedene Metabolite bestimmte immunsuppressive Wirkung wurde mit Literaturwerten aus Zellkulturexperimenten verglichen. Um die Aussagekraft der Methode bei der Analyse von Blutproben abzusichern, wurden Patientenproben in der Zeit nach der Transplantation mit den drei Analysensystemen (HPLC, TDx, Biacore) vermessen. Durch die Zusammenarbeit von Inventus BioTec mit dem Labor der Uniklinik Münster ergab sich bei der üblichen intensivmedizinischen Betreuung von Organempfängern die Möglichkeit, viele klinische Daten über die transplantierten Patienten zu erhalten. Somit sind etwaige Einflußgrößen und Störfaktoren auf den zu entwickelnden Test in der präanalytischen Phase gut zu untersuchen. So konnte für einige medizinische Parameter die Überlegenheit der Biacore-Analytik gegenüber bisherigen Methoden bewiesen werden.


Ergebnisse und Diskussion

Die Methode der Festphasenextraktion von CsA ist für die Bestimmung mit dem Biacore optimiert worden. Dabei wurde für CsA eine Wiederfindungsrate von 74,1 ± 3,9 % nachgewiesen; die Präzision des Meßgerätes selbst liegt bei Vermessung eines Standards bei 0,7% und eines Extraktes bei 0,9%. Bei der Extraktion konnte auf die Verwendung von Acetonitril verzichtet werden. Da die Messung mit dem Biacore selbst gänzlich ohne den Einsatz organischer Lösungsmittel auskommt, bleibt bei Einsatz der Methode in der Routineanalytik anstelle der HPLC die im Antrag beschriebene Einsparung von 3.960 Litern hochreinem Acetonitril bzw. von 6.930 Litern zu entsorgendem Acetonitril/Wasser-Gemisch pro Jahr bestehen. Die Untersuchung der Komplexbildung von verschiedenen CsA-Derivaten, CsA-Metaboliten, künstlichen Derivaten und natürlichen Cyclosporinen mit dem Biacore ergab sehr unterschiedliche Fähigkeiten der verschiedenen Substanzen, den ternären Wirkkomplex auf dem Sensorchip auszubilden. Dem gegenübergestellt wurden die von verschiedenen Autoren in unterschiedlichen Zellkulturexperimenten ermittelten immunsuppressiven Wirkungen der entsprechenden Substanzen. Es stellte sich heraus, daß die mit dem Biacore ermittelte Komplexbildungsaktivität gut mit den Ergebnissen der Zellkulturen korreliert. Ein Vergleich der Meßergebnisse der untersuchten Analysensysteme für die Bestimmung von CsA im Blut ergab eine Korrelation zwischen Biacore und TDx von 0,567 (n = 194) und zwischen Biacore und HPLC von 0,574 (n = 151). Die mit dem Biacore ermittelten CsA-Werte sind im Durchschnitt um 20% größer als die TDx-Werte und im Durchschnitt um 40% größer als die HPLC-Werte. Da mit der HPLC-Methode die reine CsA-Konzentration bestimmt wird, hat die Anwesenheit von Metaboliten offensichtlich einen recht großen Einfluß auf die Biacore-Bestimmung. Die Korrelation der Ergebnisse der verschiedenen Methoden mit klinischen relevanten Daten der Patienten ergab eine gute negative Korrelation der mit dem Biacore gemessenen CsA-Äquivalent-Werte und der absoluten Zahl an Leukozyten, B-Lymphozyten und cytotoxischen T-Zellen sowie eine gute Korrelation zu dem prozentualen Wert der Monozyten-, Basophilen- und T-Lymphozytenzahl. Die Ergebnisse der TDx- sowie der HPLC-Methode zeigen eine im Vergleich zur Biacore-Methode schlechtere Korrelation auf. Eine signifikante Korrelation zwischen den Ergebnissen der mit dem Biacore gemessenen CsA-Äquivalent-Werten und der Konzentration der Zellen des Immunsystems beweist folglich einen direkten Zusammenhang zwischen dem Meßwert für die Aktivität von CsA und seinen Metaboliten und der Immunsuppression des Patienten. Die Werte der Klinischen Chemie zeigen weiterhin eine signifikante Korrelation zwischen der Biacore-Methode mit den Blutwerten Cholesterin, Bilirubin und Alkalischer Phosphatase. Die beiden letztgenannten Blutwerte werden zur Kontrolle der Leberfunktion des Patienten herangezogen, so daß eine positive Korrelation mit den gemessenen CsA-Äquivalent-Werten auf einen Zusammenhang zwischen erhöhten CsA- bzw. CsA-Metabolit-Werten und verschlechterter Leberfunktion des Patienten hinweist. Es ist bekannt, daß besonders CsA-Metabolite für die toxische Wirkung des Medikamentes verantwortlich sind. Eine signifikante Korrelation mit Cholesterin ist von besonderem Interesse, da einige Studien diesen Parameter als Prognosefaktor bei schwer erkrankten Patienten ermittelt haben. Weiterhin zeigen Untersuchungen, daß niedrige Konzentrationen von Cholesterin in Verbindung mit erhöhten CsA-Metaboliten häufig zu neurologischen Symptomen führen. Diese Nebenwirkungen sind für eine deutliche Verschlechterung bei der Pflege und der Dauer des Krankenaufenthaltes verantwortlich.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

· Protection of Organ Transplants by Control of the Immunosuppressive Activity of Cyclosporin A, präsentiert auf der DECHEMA-Tagung 1999 in Wiesbaden und publiziert im Tagungsband
· Innovative Receptor Assay for the Determination of the Immunosuppressive Activity of Cyclosporin A, präsentiert auf dem 10. Heiligenstädter Kolloquium 2000 und und publiziert im Tagungsband sowie präsentiert auf dem BioGenTec-Forum NRW-2001
· Innovative Receptor Assay for the Determination of the Immunosuppressive Activity of the Drug Cyclosporin A and Its Metabolites, vorgetragen auf dem Workshop Toxicity sensors in Hannover, 2001 und auf dem BioGenTec-Forum NRW-2001 in Köln
· Beate Vollenbröker, Manfred Fobker, Bernfried Specht, Norbert Bartetzko, Michael Erren, Friedrich Spener und Helge Hohage. Receptor Assay Based on Surface Plasmon Resonance for the Assessment of the Immunosuppressive Activity of Cyclosporin A and Its Metabolites. Analytical Biochemistry, eingereichtEine Publikation, in der klinische Daten präsentiert werden sollen, ist in Vorbereitung und soll in dem Journal Transplantation veröffentlicht werden


Fazit

Zusammengefaßt läßt sich für die untersuchten Blutproben von Transplantationspatienten sagen, daß mit dem Biacore der Status der Immunsuppression von Patienten am besten bestimmt wird. Weiterhin ist eine verbesserte Korrelation mit der Leberfunktion der Patienten im Vergleich zum TDx zu verzeichnen. Die Korrelationen der Ergebnisse der HPLC mit den Werten, die die Immunsuppression und das Auftreten von Nebenwirkungen widerspiegeln, sind deutlich schlechter, da mit der HPLC-Methode das Auftreten der Metabolite nicht quantifiziert wird. Die Ergebnisse entsprechen den Erwartungen und unterstützen die Vermutung, daß durch Bestimmung der CsA-Aktivität mit Hilfe des in vivo-Wirkkomplexes die CsA-Analytik erheblich verbessert wird. Im Rahmen des Statusseminars in Frankfurt am 23.-24. April 2001 wurde vom Gutachter angeregt, die Arbeiten auf diesem Gebiet fortzuführen. Die Projektpartner beabsichtigen auch, die Zusammenarbeit auf diesem Gebiet fortzusetzen.

Übersicht

Fördersumme

150.631,19 €

Förderzeitraum

01.11.1998 - 20.08.2001

Internet

www.inventus-biotec.com

Bundesland

Nordrhein-Westfalen

Schlagwörter

Klimaschutz
Umweltforschung
Umwelttechnik