Projekt 13028/14

Förderschwerpunkt Biotechnologie: Verbund Sensorik in der Biotechnologie: Entwicklung eines Meßsystems zum Nachweis von Fusarium

Projektträger

Jüke Systemtechnik GmbH
Trumpenstiege 2
48341 Altenberge
Telefon: 02505/8704

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Um vom Schimmelpilz Fusarium - verantwortlich für die Bildung von Mykotoxinen und das Phänomen des Gushing (deutsch: Wildwerden) von Bier - befallenes Getreide in Mälzereien oder Brauereien rasch zu erkennen und auszuschleusen, wird ein Meßverfahren auf Basis der Turbidometrischen Fließinjektions-Immunoanalyse (TIA) entwickelt. Im Feldversuch eines Brauerei-Laboratoriums soll durch Gegenüberstellung mit bisher angewandten Methoden gezeigt werden, dass das Meßverfahren einen erheblichen Zeitvorteil besitzt und sich als zuverlässigerer Präindikator für Fusarien-Kontaminationen eignet. Ziel ist es, dem Markt eine Messgerätelösung zur Verfügung zu stellen, welche das Einbringen belasteten Rohmaterials in die Produktion von Mälzereien bzw. Brauereien schon in der Wareneingangs- und Qualitätskontrolle verhindert, somit zu Verbraucherschutz und Ressourcenschonung (Energie, Wasser, Rohstoffe) beiträgt und zudem Modellcharakter für weitere Anwendungen z.B. Lebensmittelindustrie aufweist.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenNach der Definitionsphase (ca. 2 Monate) sorgte die Märkische Fachhochschule (MFH) Iserlohn in der Anfangsphase (ca. 11 Monate) für den Aufbau des Latex-Agglutinationstests ( LAT ) zur Bestimmung fusariengattungsspezifischer, extrazellulärer Polysaccharide (EPS). Die Validierung (Nachweis der Korrelation zwischen Fusarien-Befall und EPS-Gehalt) des von Hand durchgeführten Tests erfolgte zunächst mittels kultureller Untersuchungen anhand von Realproben. Auch eine nicht kontaminierte Gersten-Probe wurde aus Spanien beschafft und im Labor probeweise kontaminiert zur vergleichenden Validierung des Nachweises mittels EPS-LAT und PCR. Auch der zeitliche Verlauf der Kontamination wurde so verfolgt.
Anschließend wurde der Latex-Agglutinationstest an die Fließinjektionsanalyse adaptiert (turbidometrische Fließinjektions-Immunoanalyse - TIA). Als Gerätebasis zur Realisierung dieses TIA-Verfahrens wurde ein modulares Fließanalyse-(FIA-)System aufgebaut und als fertiges Laboranalysegerät konfektioniert, das die automatische Abarbeitung von Proben, die Datenerfassung und -auswertung ermöglicht.
Die Adaption des Latex-Agglutinationstests zur Bestimmung von Fusarium-EPS auf die FIA, die Optimierung des Verfahrens und
Validierung des Messgeräts wurde in enger Abstimmung zwischen der JÜKE Systemtechnik GmbH und der MFH Iserlohn durchgeführt.
Die Validierung, bei der die Korrelation zwischen Fusarium-EPS und Fusarien-Befall nachzuweisen ist, erfolgte mittels kultureller Methoden, welche von der MFH Iserlohn durchgeführt wurden, sowie eines PCR-Verfahrens (nach: M.L. Niessen, R.S. Vogel, Group Specific PCR - Detection of potential Trichothecene producing Fusarium species in Pure Cultures and Cereal Samples, System. Appl. Microbiol. 21 (1998), 618-631). Die Entwicklung der PCR-Methode und Durchführung der Untersuchungen mit der PCR wurden bei der Lebensmittellabor Dr. Weßling GmbH in Altenberge in Auftrag gegeben.Nach dem Redesign, in welcher Optimierungen im Hinblick auf einen zuverlässigen Serienstand erfolgen sollte, sollte das Messgerät schließlich im Feldversuch eines Mälzerei- bzw. Brauerei-Laboratoriums erprobt werden. Dort sollte es bisher angewandten Methoden wie kulturellen Untersuchungen und der manuellen Auslese roter Körner (Handbonitierung), welche zu lange Analysenzeiten oder unzureichende Korrelationen zu Mykotoxingehalt oder Gushing-Neigung aufweisen, alternativ gegenüber gestellt werden.


Ergebnisse und Diskussion

Die mehrfach öffentlich vorgestellten Ergebnisse zeigen eine deutliche Korrelation zwischen dem Grad an Fusarium - Kontamination und der Reaktion im EPS-LAT einerseits und dem PCR gestützten Nachweis andererseits. Der von Hand durchgeführte Test eignet sich daher sehr gut für ein schnelles Screening. Der Versuch der Automatisierung durch Nutzung eines Photometers ergab zwar interpretierbare Ergebnisse in Bezug auf Kontamination, zeigt aber eine Schwachstelle beim notwendigen, zwischengeschalteten Zentrifugationsschritt auf. Dieser erfordert Fingerspitzengefühl, denn je nach Art des Abzugs des Überstands zur Photometrie kann man unterschiedliche Trübungen erhalten, die nur Falschwerten entsprächen. Ein Ansatz zur Lösung des Problems mit dem Zentrifugationsschritt wurde in der Filtration gesehen. Doch Vorversuche ergaben stets eine fast komplette Adsorption / Filterung der Latex-Antikörper, so dass das Filtrat stets die gleich Extinktion / Trübung aufwies, unabhängig vom zugegebenen EPS-Gehalt. Die Suche nach anderen Filtern blieb erfolglos.
Zur Vermeidung des Zentrifugationsschritts wurde der Testansatz nach Herstellung per Hand direkt in die FIA injiziert und die Trübung vermessen. Da die Trübungsunterschiede der einzelnen Proben zu gering ausfallen, kann diese Direktmessung nicht weiter genutzt werden. An den erhaltenen Ergebnissen war deutlich zu erkennen, dass trotz ausreichender Signalausbeute kein erkennbarer Unterschied zwischen EPS-Standards unterschiedlicher Konzentrationen besteht (dies konnte in mehreren Versuchsreihen mit unterschiedlichen Methoden und verschiedenen Konzentrationen bewiesen werden). Zu diesem Zeitpunkt wird daher davon ausgegangen, dass der EPS-Test in der FIA nicht kalibrierbar und eine Automatisierung des Tests nicht möglich ist. Im Handling der Lösungen ergab sich zudem die Problematik einer störenden Sedimentation des Latex-Agglutinationsreagenz.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Neben den Tätigkeiten, die von der Koordinationsstelle des Verbunds Sensorik in der Biotechnologie ausgeübt werden (z.B. Präsentation der Einzelprojekte im Internet, Präsentation des Verbundes auf der BIOTECHNICA 99), wurden bisher folgende Veröffentlichungen und Präsentationen verwirklicht:
- Posterpräsentation während der DECHEMA-Jahrestagung vom 27.-29.04.99 in Wiesbaden
- Beitrag in der Chemischen Rundschau vom 07.01.00
- Posterpräsentation GVC-Tagung Prozeßmeßtechnik in der Biotechnologie v. 08.-09.05.00 in Bamberg
- Vortrag am 24.05.00 während der 26. Ausstellungstagung Internationales Treffen für chem. Technik, Umweltschutz und Biotechnologie (ACHEMA 2000) in Frankfurt
- Posterpräsentation beim 10. Heiligenstädter Kolloquium Technische Systeme für die Biotechnologie und Umwelt (09.-11.10.00)
- Vortrag auf dem Toxicity Workshop im ITC der Uni Hannover ( 5.2.2001)
- Vortrag und Posterpräsentation auf dem BioGenTec-Forum in Köln ( 28.2. - 1.3.2001 )
- Poster auf der 19. DECHEMA Jahrestagung der Biotechnologen in Leipzig ( 13. - 15.4.2001 )
- Poster auf der BIOSENSOR 2001 in Tübingen ( 1. - 3.4.2001 )


Fazit

Aufgrund der unzureichenden Ergebnisse bei dem Versuch, den EPS-Test an die FIA zu adaptieren, wurde es als nicht sinnvoll bewertet, Meilensteine 5 und 6 (Redesign und Feldtest) in Angriff zu nehmen. Das Projektvorhaben wurde daher an dieser Stelle abgebrochen. Es erscheint nicht sinnvoll, die bisher entwickelten Methoden weiter zu verfolgen, wenn die Absicht besteht, den Test in eine automatisierte Form zu überführen. Über die Möglichkeit, mit modernen rechnergestützten Bildverarbeitungsmethoden den einfachen EPS Test zu adaptieren, soll an anderer Stelle diskutiert werden.

Übersicht

Fördersumme

166.604,46 €

Förderzeitraum

01.01.1999 - 06.12.2001

Bundesland

Nordrhein-Westfalen

Schlagwörter

Klimaschutz
Umweltforschung
Umwelttechnik