Projekt 13000/01

Förderschwerpunkt Biotechnologie: Etablierung eines funktionalen bio-Operons in Corynebacterium glutamicum – ein Weg zur biotechnologischen Biotin-Synthese

Projektträger

Georg-August-Universität GöttingenFakultät für Biologie und PsychologieInstitut für Mikrobiologie und Genetik
Grisebachstr. 8
37077 Göttingen
Telefon: 0551/393775

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Die derzeitige industrielle Produktion von Biotin (Vitamin H) erfolgt auf chemischem Wege, ein effizientes biotechnologisches Verfahren ist nicht verfügbar. Im Rahmen des Projekts sollen bisher unbekannte Biotinbiosynthesegene aus kultivierbaren und nichtkultivierbaren Mikroorganismen isoliert und charakterisiert werden. Die so isolierten Gene können als Bausteine für die Etablierung artifizieller Biotinbiosynthesewege in ausgewählten Mikroorganismen dienen. Mit rekombinanten Methoden zusammengestellte bzw. verbesserte Biotinbiosynthesewege dieser Art könnten als Basis für die Entwicklung eines fermentativen Prozesses zur Herstellung von Biotin dienen und so neue Wege als mögliche Alternativen zur chemischen Biotinproduktion aufzeigen.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenMethoden, die bei der Isolierung der neuartigen Biotinbosyntheseoperons angewandt wurden, sind im Vorjahresbericht, sowie in der Publikation von Entcheva et al. (2001) beschrieben. Im laufenden Projektjahr wurde sehr viel Zeit auf eine Charakterisierung der isolierten bio-Operons mit molekularen Methoden verwendet. Hierbei handelt es sich um Sequenzierung der isolierten bio-Gene und der flankierenden Regionen. Dazu wurden im wesentlichen klassische Klonierungen und DNA-Sequenzanalysen verwendet. Weiterhin wurden initiale Funktionsanalysen durchgeführt, um eine Einstufung der bio-Operons bezüglich der Biotinsyntheseleistung durchführen zu können. Hierbei wurden vor allem analytische Messungen vorgenommen, um die Biotinsyntheseraten in Abhängigkeit der Zeit und von C-Quellen im Medium zu ermitteln. Hauptnachweisverfahren, die dabei zum Einsatz kamen, waren der Nachweis von Biotin in Kulturüberständen mittels ELISA oder Lactobacillus-Wachstumstest. Für das Herstellen von Biotin-überproduzierenden Bakterien wurden klassische Klonierungstechniken verwendet.


Ergebnisse und Diskussion

Im Rahmen des Projekts wurden bereits eine ganze Reihe sogenannter Milestones erfolgreich abgearbeitet. Zunächst wurde nicht nur eine neue Technik für die Isolierung neuer Biotinsyntheseoperons aus Umweltgenbanken erarbeitet, sondern die Technik konnte auch genutzt werden, um etliche neue bio-Operons zu isolieren. Vier dieser bio-Operons wurden detailliert molekularbiologisch charakterisiert, wobei eines der bio-Operons nun Gegenstand weiterer Klonierung ist und zur Konstruktion eines Biotin-überproduzierenden Stammes genutzt wird. Die eingeschlagene Vorgehensweise hat sich bisher als sehr erfolgreich erwiesen. Wir hoffen nun, dass wir mit Hilfe der Stammkonstruktionen und Optimierungen zumindest einige Biotin-überproduzierende Stämme herstellen können. Zur Zeit können wir jedoch nicht abschätzen, ob die Produktionsraten solcher Konstrukte ausreichen werden, um eine Biotinproduktion in einem biotechnologischen Verfahren kostendeckend zu etablieren. Vergleicht man die Produktionsraten von bisher in Industriepatenten beschriebenen Stämmen, so fällt auf, dass wir mit unseren Stämmen in den Bereich von ca. 100 mg/l kommen müssen, um mit patentierten Stämmen konkurrieren zu können. Wir hoffen, dass wir in der verbleibenden Zeit zumindest einen Stamm konstruieren können, der diese Kriterien annähernd erfüllt. Letztendlich werden wir in einigen Monaten damit beginnen, mögliche Industriepartner zu kontaktieren, um einen Fortgang des Projekts auch weiterhin zu ermöglichen.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Entcheva, P. , W. Liebl, A. Johann, T. Hartsch and W. R. Streit (2001): Direct cloning from enrichment cultures, a reliable strategy for the isolation of complete operons and genes from microbial consortia. Appl. Environm. Microbiology. 67,1:89-99


Fazit

Die eingeschlagene Strategie hat im ersten Abschnitt zur Isolierung neuer z. T. sehr effizienter Biotinbiosynthesegene geführt. Diese bio-Operons wurden im Anschluss genutzt, um eine breite Palette von definierten Konstrukten für eine Überproduktion in unterschiedlichen Wirten zu erstellen. Weitere Arbeiten konzentrierten sich mit der Stammoptimierung und der damit verbundenen Überproduktion. Ziel ist es, innerhalb absehbarer Zeit aus den bereits vorliegenden Konstrukten Hochleistungsstämme zu erhalten, die tatsächlich für eine Überproduktion geeignet sind. Wir stehen zur Zeit mit der Fa. RTM-Technologies in Verhandlung, um weitere bio-Operons aus Umweltproben zu isolieren und gleichzeitig Biotin-überproduzierende Bakterienstämme zu konstruieren.