Projekt 03402/01

Automatisierung von Nachweisverfahren für die Beurteilung des kanzerogenen Risikos durch Umweltbelastungen: Verbesserungen beim Nachweis gentoxischer Effekte von Umweltschadstoffen

Projektträger

Ludwig-Maximilians-Universität MünchenWalther-Straub-InstitutAbteilungToxikologie
Nussbaumstr. 26
80336 München
Telefon: 089/2180-73-802

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

Die Beurteilung des kanzerogenen Risikos für die Bevölkerung gewinnt immer größere Bedeutung. Für die Krebsentstehung relevante Stoffe, wie Nitrosamine, aromatische Amine und polycyclische Kohlenwasserstoffe stammen aus der Umwelt, daneben aber auch aus Pharmaka, Nahrungs- und Genußmitteln. Das krebserregende Potential von Substanzen wird im Tierversuch ermittelt. Die frühesten nachweisbaren Veränderungen nach Kanzerogenaufnahme sind die Bildung kovalenter Addukte an die DNA. Eines der sensitivsten Methoden zur Erfassung solcher Addukten stellt derzeit das 32P-Postlabeling dar. Die bisherigen Verfahren haben jedoch noch eine Reihe von Mängeln, die den Einsatz für ein effektives Biomonitoring am Menschen stark einschränken. Eine entscheidende Verbesserung der bisher beschriebenen analytischen Methoden zu erreichen, ist das Ziel dieses Forschungsvorhabens.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie am häufigsten verwendeten Analysenverfahren wurden von uns vergleichend untersucht, mit dem Ziel die jeweiligen Schwächen zu charakterisieren und zu wesentlichen Verbesserungen zu kommen. Hierzu wurde die DNA von Ratten und Mäusen gewonnen, die zuvor mit Kanzerogenen, z.B. 4-Aminobi-phenyl, o-Toluidin, Benzo[a]pyren, behandelt worden waren. Für die beiden erstgenannten Substanzen wurde das wichtigste DNA-Addukt synthetisiert um für die Chromatographie Vergleichsstandards zu bekommen. Nach Isolierung der DNA und Verdau zu den Mononukleotiden wurden folgende Verfahren zur Analyse der Addukte (ca 1 Addukt in 106 bis 1010 normalen Nukleotiden !) angewendet: Verdau mit Nuklease P1; Extraktion mit Butanol; Labeln mit ATP-Unterschuß; Festphasenextraktion offline mit C18-und LMS-BondElut-Säulchen und PEI (Polyethyleneimin), oder online in der HPLC-Anlage mit C18-Säulen (Vorsäulenschalttechnik); die Analyse erfolgte wahlweise auf PEI-DC-Platten oder durch HPLC auf verschiedenen Säulen, der Nachweis der radioaktiven Proben durch Phosphor-Image-Analyse (DC, HPLC-Blotting) oder online durch Radioaktivitätsmonitoring. Als völlig neues Verfahren wird das HPLC-Blotting entwickelt. Dabei wurde das HPLC-Fließmittel nach der Säule auf Filterpapier aufgetragen. Die aufgetragenen Bahnen des Filters wurden anschließend auf Radioaktivität untersucht.


Ergebnisse und Diskussion

Es hat sich gezeigt, daß ein wichtiger Schritt in den meisten publizierten Analysenprotokollen, die Anreicherung der Nukleotid-Addukte, mit großen Verlusten verbunden ist. Dies gilt für die Anreicherung durch Butanol- oder offline Festphasenextraktion ebenso wie für den Verdau mit Nuclease P1. Andererseits belastet bei direktem Labeling mit anschließender HPLC-Analyse ein zu hoher Anteil normaler Nukleotide die Analyse. Außerdem wird bei diesem Verfahren mit einem Unterschuß an radioaktivem ATP gelabelt. Dies führt zu nicht reproduzierbaren Ausbeuten und macht eine quantitative Analyse unmöglich. Deshalb müssen dringend weitere Anstrengungen unternommen werden um die normalen Nukleotide reproduzierbar von den Addukt-Nukleotiden bereits vor dem Labeln abzutrennen.
Die reproduzierbare Trennung der Addukte durch HPLC ist ein ganz wesentlicher Vorteil gegenüber der Dünnschichtchromatografie. Allerdings ist die Nachweisempfindlichkeit im Radioaktivitätsdetektor wegen der kurzen Zählzeiten begrenzt. Ein Peak ist maximal 2 min in der Durchflußzelle, während die DC-Platte fast beliebig lang exponiert werden kann. Wir haben deshalb ein Blotting-Verfahren entwickelt, bei dem das HPLC-Eluat der HPLC-Säule auf Zellulose-Platten aufgetragen wird. Die Radioaktivitätsmessung kann dann in der gleichen Weise wie bei den DC-Platten durch Exposition von Fuji-Imaging Platten und Auswertung mit einem Fuji Bio-Imaging Analyzer vorgenommen werden. Dies höht die Nachweisempfindlichkeit um eine bis zwei Größenordnungen. Durch die Beschichtung der Zellulose mit einem Ionenaustascher (1% PEI-Lösung) wird verhindert, daß die Nukleotidaddukte mit dem HPLC-Eluat vom Auftragungsort wegdiffundieren und die Trennung der Peaks keine Einbußen erleidet. Anhand von Leber-DNA von Ratten, die mit 4-Aminobiphenyl (4-ABP), o-Toluidin (OTD) und Benzo[a)pyren (BP) behandelt wurden, zeigte sich, daß mit dieser Methode das HPLC-Chromatogramm nicht nur reproduziert, sondern auch eine Reihe von zusätzlichen Addukten geringerer Intensität detektiert werden können.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Mit Hilfe der DBU wurde im Dezember 1994 ein Workshop organisiert, an dem sich die meisten Arbeitsgruppen beteiligten, die sich in Deutschland mit dem 32P-Postlabeling beschäftigen. Aufgrund des guten Erfolges dieses Workshops und der anschließenden großen Nachfrage der Teilnehmer wurde 1996 ein zweiter Workshop von Prof. Wießler am DKFZ in Heidelberg ausgerichtet. Dabei wurden besonders die HPLC-Methoden ausführlich diskutiert. Der dritte Workshop 1997 in Würzburg am Institut für Toxikologie, der von Prof. Eder ausgerichtet wurde, zeigte erneut, daß HPLC-Methoden immer größeres Interesse finden. Im Rahmen eines HPLC-Seminars unter der Leitung von Prof. Kuß, Abteilung Neurochemie der Psychiatrischen Klinik der LMU, konnten wir speziell unsere HPLC-Methode präsentieren und diskutieren. Unsere HPLC-Methode wurde ebenfalls dem Arbeitskreis: Untersuchung einer möglichen Gesundheitsgefährdung durch berufliche Exposition gegenüber Zytostatika des Instituts für Arbeits-und Umweltmedizin vorgestellt. Außerdem wurden unsere bisherigen Ergebnisse auf einem internationalen Kongreß in Kalifornien präsentiert. Nachfolgend sind die bisherigen Kurzveröffentlichungen aufgeführt. Außerdem ist zu diesem Thema bereits eine Diplomarbeit in Chemie abgeschlossen worden und eine Doktorarbeit steht kurz vor ihrem Abschluß.
Nguyen PT Specht A Schulze J Richter E (1994) Entwicklung einer HPLC-Methode zum Nachweis von 32P-DNA-Addukten von 4-Aminobiphenyl. 32P-Postlabelling Workshop, Walther-Straub-Inst.f. Pharmakol. u. Toxikol., München, 2.-3.12.
Nguyen P-T Specht A Richter E (1995) Detection of aromatic amine DNA adducts by 32P-postlabeling with online HPLC enrichment. 6th Int Conf on Carcinogenic/Mutagenic N-Substituted Aryl Compounds, Monterey, CA, 4.-8.11.1995
Nguyen P-T Specht A Schwaiger U Richter E (1996) Improved determination of aromatic amine DNA adducts by 32P-postlabeling with HPLC enrichment and blotting. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 353 (Suppl): R135
Nguyen P.-T., Specht A. and Richter E. (1998) Improved detection of DNA adducts by 32P-Postlabeling with online HPLC enrichment and blotting, Carcinogenesis, submitted
Specht A (1994) Bestimmung von DNA-Addukten von 4-Aminobiphenyl durch 32P-Postlabelling und HPLC. Diplomarbeit aus dem Fachgebiet Biochemie der Naturwissenschaftlichen Fakultät der LMU


Fazit

Die in dem Projekt erzielten Ergebnisse zeigen, daß das Verfahren des 32P-Postlabeling zum Nachweis der Belastung des Menschen mit kanzerogenen, umweltrelevanten Schadstoffen geeignet ist, wenn man sich die bessere Trennleistung der HPLC und die wesentlich erhöhte Nachweisempfindlichkeit durch die neuentwickelte Technik des HPLC-Blotting zunutze macht. Die von uns entwickelte Blottingmethode wird der HPLC-Analytik beim 32P-Postlabeling endgültig zum notwendigen Durchbruch verhelfen. In Verbindung mit der Säulenschalttechnik können Nachweisgrenzen erreicht werden, die denjenigen in der DC-Analytik um nichts nachstehen. Für die kommerzielle Nutzung gilt es nun ein Blottinggerät zu entwickeln und einen Hersteller zu finden, der das PEI-beschichtete Filterpapier für die Anforderungen des Blotting optimiert. Wir sind zuversichtlich, daß diese Methode dann in der Umweltanalytik für das Biomonitoring kanzerogener Substanzen breite Anwendung finden wird.