Projekt 01150/01

Einsatz nichtradioaktiver Markierungsverfahren zur Prüfung zellulärer Immunreaktionen in-vitro

Projektträger

Tierärztliche Hochschule Hannover Klinik für Geflügel
Bünteweg 17
30559 Hannover
Telefon: 0511/9538778

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens

In-vitro-Messungen immunologischer Leistungen zählen zu essentiellen Bestandteilen der experimentellen und klinischen Immunologie bei Mensch und Tier. So ist z. B. die Messung des Aktivierungspotentials von Immunzellen, wie Phagozyten, T-Lymphozyten, B-Lymphozyten, für die Immundiagnostik und für die Grundlagenforschung gleichermaßen von Bedeutung. Hierdurch können regelhaft ablaufende, aber auch abweichende Reaktionen des Immunsystems, z. B. Immunsuppressionen, ermittelt werden. Vielen dieser Verfahren liegt als Markierungsprinzip für die Messung der Zellaktivität (Blastogenese, Zellteilung) der Einsatz von Isotopen zugrunde, wobei radioaktiv markierte DNA-Base /z. B. 3H-Thymidin) in-vitro in die zelluläre DNA eingebaut wird. Die resultierenden Einbauraten können dahingehend interpretiert werden, daß zelluläre immunologische Leistungen regelhaft ablaufen oder gestört sind.
So sehr sich diese Verfahren bewährt haben, setzen sie hochspezialisierte Laboratorien mit entsprechend aufwendiger apparativer Ausstattung voraus und stellen besondere Anforderungen an Maßnahmen zur Personal- und Laborsicherheit (Strahlenschutzverordnung). Insbesondere wird die Entsorgung des anfallenden radioaktiven Materials notwendig. Um diese Problematik zu umgehen, ist gerechtfertigt, Alternativen zu diesen Verfahren zu prüfen. Daher ist beabsichtigt, an Leukozytenfraktionen des Huhns in-vitro zu prüfen, inwieweit bei Anwendung nicht-radioaktiver Markierungsmethoden (Tetrazoliumsalz MTT) zelluläre Immunreaktionen mit gleicher Präzision gemessen werden können wie mit herkömmlichen Methoden, die unter Verwendung von Isotopen durchgeführt werden.
Somit haben die geplanten Untersuchungen zum einen Modellcharakter, zum anderen sollen sie neue Perspektiven der veterinärmedizinischen Immundiagnostik mit erhöhter Labor- und Personalsicherheit und Minderung der Entsorgungsproblematik aufzeigen. Damit soll es den risikoarmen Einsatz eines immundiagnostischen Verfahrens ermöglichen, das sowohl in der Pathogeneseforschung multifaktorieller, infektiöser und nichtinfektiöser Erkrankungen des Geflügels als auch in der angewandten Immundiagnostik applizierbar ist.


Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenEntsprechend dem in der Antragstellung formulierten Arbeitsprogramm wurde der Lymphozyten-Transformationstest (LTT) zunächst im konventionellen Verfahren unter Verwendung von 3H-Thymidin etabliert, wobei die Mitogene Concanavalin A (Con A) und Phytohämagglutinin (PHA) zur Anwendung gelangten. Parallel hierzu wurden entsprechende Vorversuche zur Optimierung des Einsatzes des Tetrazoliumsalzes MTT (3 (4,5-Dimethyl-Thiazoyl-2-yl) 2,5 Diphenyl-Tetrazolium-Bromide) durchgeführt, das als Alternative zum Einsatz des 3H-Thymidin dienen sollte. Im Rahmen dieser vorbereitenden Experimente wurden gleichzeitig die Verfahren der Leukozytengewinnung und -kultivierung, Inkubationsdauer, spektralphotometrische Meßverfahren, Auswertungsverfahren sowie statistische Verfahren auf ihre Eignung hin untersucht. Die erzielten methodischen Ergebnisse gelangten anschließend an drei Tiergruppen, bestehend aus Legehybriden, zur Anwendung. Hierbei wurde die Eignung der entwickelten Verfahren in Kurzzeitversuchen und in zwei Langzeitversuchen (21-28 Lebenswochen bzw. 67-75 Lebenswochen) im Sinne der Versuchsthematik geprüft. Die Ergebnisse dieser Vorversuche ermutigten, den Einsatz dieses Verfahrens auch auf andere Vogelspezies zu erweitern, die zum einen von kommerziellem Interesse für die Lebensmittelproduktion (Puten, Masthähnchen, Enten) sind, zum anderen als Bioindikatoren mariner Ökosysteme (Möwen) gelten.


Ergebnisse und Diskussion

Nach Erprobung verschiedener Versuchsvariablen wurden immundiagnostische Testsysteme für die Prüfung der afferenten Phase zellvermittelter Immunreaktion in-vitro erarbeitet, die nunmehr an verschiede-nen Nutzgeflügelspezies und darüber hinaus an Möwen, die als Bioindikatoren für marine Ökosysteme gelten, Anwendung finden können. Die Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass der LTT unter Einsatz von MTT im Vergleich zum LTT unter Verwendung von 3H-Thymidin eine Alternative zur Messung der Zellproliferation ist und unter den o. g. Versuchsbedingungen dazu verwendet werden kann, Proliferationen peripherer Blutleukozyten und damit immunologisch relevanter Zellen zu messen. Durch dieses Verfahren wird ein Beitrag zur Reduzierung des Einsatzes von Isotopen geleistet. Indem diese Methode - in Abweichung von bisherigen Verfahren - auch intra vitam durchführbar ist, entfällt die Tötung von Ver-suchstieren. Überdies konnte gezeigt werden, dass dieses Verfahren erfolgreich auf andere Vogelspe-zies übertragen werden konnte. Aus statistischer Sicht sollten aufgrund der individuellen starken Schwankungen die jeweiligen Stichprobengrößen 10 Tiere nicht unterschreiten.


Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation

Die erzielten Ergebnisse wurden im Rahmen einer Dissertation und wissenschaftlicher Fachvorträge anlässlich der Tagung der International Avian Immunology Research Group 1994 und 1995 vorgetragen. Über die Projektlaufzeit hinaus finden die erarbeiteten Verfahren im Rahmen von Forschungsarbeiten für Dissertationen und anderen Projekten Anwendung. Außerdem wurden externe Untersucher im Rahmen von Hospitationen an der Klinik für Geflügel der Tierärztlichen Hochschule in diese Verfahren eingearbeitet.


Fazit

Die im Rahmen dieses Projekts erzielten Ergebnisse zeigen, dass der LTT unter Verwendung von MTT im Sinne der Antragstellung für immundiagnostische Zwecke und für Fragestellungen der Pathogeneseforschung sowie im Rahmen der Prüfung zur Unschädlichkeit von Impfstoffen geeignet ist. Insofern wurde ein Beitrag zur Minderung der Entsorgungsproblematik umweltrelevanter Chemikalien erzielt. Darüber hinaus wurde dieses Verfahren im Sinne des Tierschutzes für die Applikation in-vitro entwickelt, so dass die Tötung von Versuchstieren entfällt und ein kontinuierliches Monitoring zellvermittelter immunologischer Leistungen möglich ist. Zukünftigen Untersuchungen soll vorbehalten bleiben, ob als Alternative zu MTT der Farbstoff XTT und Alamar blue Verwendung finden könnten.