Nutzung von Naturstrategien zur Vermeidung von Biofilmen an Oberfl\u00e4chen<\/p>\n
Biofilme am falschen Ort oder mit pathogenen Keimen verursachen volkswirtschaftliche Sch\u00c3\u00a4den und sind gesundheitsgef\u00c3\u00a4hrdend. H\u00c3\u00a4ufig angewandte Bek\u00c3\u00a4mpfungsstrategien sind in ihrer Anwendung und Effektivit\u00c3\u00a4t eingeschr\u00c3\u00a4nkt: Biofilme k\u00c3\u00b6nnen oftmals nicht vollst\u00c3\u00a4ndig entfernt werden oder bilden Resistenzen gegen\u00c3\u00bcber den eingesetzten Chemikalien, welche zudem oft stark toxisch und hochkorrosiv sind.<\/p>\n
Bakterien k\u00c3\u00b6nnen in Abh\u00c3\u00a4ngigkeit von der Populationsdichte ihr Verhalten \u00c3\u00bcber extrazellul\u00c3\u00a4re Signalmolek\u00c3\u00bcle steuern (Quorum Sensing, QS). So wird eine Vielzahl an bakteriellen Verhaltensweisen wie die Biofilmbildung und die Expression von Virulenzfaktoren reguliert, die durch eine St\u00c3\u00b6rung der Zell-Zell-Kommunikation beeinflusst werden k\u00c3\u00b6nnen. Typische Strategien zur Bek\u00c3\u00a4mpfung der Biofilmbildung Gram-negativer Organismen \u00c3\u00bcber das QS beinhalten die kompetitive Inhibition des Signalmolek\u00c3\u00bclrezeptors durch ein Strukturanalogon und den enzymatischen Abbau des Signalmolek\u00c3\u00bcls N-Acylhomoserinlacton (AHL).<\/p>\n
Grundvoraussetzungen f\u00c3\u00bcr den praktischen Einsatz eines biofilmreduzierenden Wirkstoffes sind seine Verf\u00c3\u00bcgbarkeit und seine Wirkung, idealerweise mit einem breiten Wirkspektrum, sowie ferner seine Darreichungsform, beispielsweise als Oberfl\u00c3\u00a4chenbeschichtung oder in Form einer Formulierung. Die Wirkung von AHL-Lactonasen auf die Biofilmbildung und die Produktion von Virulenzfaktoren sind in der Literatur beschrieben als Untersuchungen, in denen entsprechende Gensequenzen, vor allem aiia, in die untersuchte Zielspezies kloniert und das Verhalten dieser Mutanten mit ihren jeweiligen Wildtypen verglichen wurden. Diese Art der Wirkungsbestimmung wurde angewandt, da AHL-Lactonasen derzeit nicht kommerziell verf\u00c3\u00bcgbar sind. Die Expression der AHL-Lactonasen erfolgte in bisherigen Studien vor allem mit Escherichia coli im Sch\u00c3\u00bcttelkolbenma\u00c3\u0178stab mit geringen Ausbeuten von bis zu 54 mg\/L, um die Struktur von AiiA und AiiB aufzukl\u00c3\u00a4ren und ihre Aktivit\u00c3\u00a4t zu bestimmen.<\/p>\n
Ziel dieser Arbeit war es in das QS Gram-negativer Bakterien einzugreifen, um deren Biofilmwachstum zu hemmen und die Bildung von Virulenzfaktoren zu reduzieren Dar\u00c3\u00bcber hinaus wurde das Potential von AHL-Lactonasen, beispielhaft an AiiA, AiiB und BlcC (ehemals AttM), als antibakterielle Wirkstoffe ermittelt. Um dies zu erreichen, wurden die AHL-Lactonasen AiiA, AiiB und BlcC zun\u00c3\u00a4chst in E. coli in einem 7 L-Bioreaktor exprimiert und \u00c3\u00bcber chromatographische Methoden aufgereinigt. Anschlie\u00c3\u0178end wurde ihre Wirkung auf das QS anhand der Biofilmbildung und der Produktion unterschiedlicher Virulenzfaktoren an ausgew\u00c3\u00a4hlten Gram-negativen Bakterienst\u00c3\u00a4mmen untersucht. F\u00c3\u00bcr einen praktischen industriellen Einsatz wurden sie zur Demonstration der Machbarkeit an Partikeloberfl\u00c3\u00a4chen und mit Maltose ausger\u00c3\u00bcsteten Flachsubstraten physisorbiert, an COOH- und NH2-funktionalisierten Oberfl\u00c3\u00a4chen gebunden sowie in ein Hydrogel eingeschlossen. Auch diese Oberfl\u00c3\u00a4chenbeschichtungen und Formulierungen wurden auf ihre Biofilm-reduzierenden Eigenschaften analysiert.<\/p>\n
Zun\u00c3\u00a4chst wurden AiiA, AiiB und BlcC in einer Hochzelldichtefermentation mit bis zu 1,2 g\/L exprimiert und auf eine Reinheit von 99 % aufgereinigt. Anschlie\u00c3\u0178end wurden die mit MALDI-TOF verifizierten AHL-Lactonasen AiiB und BlcC hinsichtlich ihrer hydro-dynamischen Radien (2,42 \u00c2\u00b10,12 nm f\u00c3\u00bcr AiiB und 2,37 \u00c2\u00b1 0,12 nm f\u00c3\u00bcr BlcC), ihrer iso-elektrischen Punkte (5,45 f\u00c3\u00bcr AiiB und 5,75 f\u00c3\u00bcr BlcC) und ihrer Sekund\u00c3\u00a4rstruktur (AiiB mit 11,4 \u00c2\u00b12,2 % ?-Helix und 36,2 \u00c2\u00b12,9 % ?-Faltblatt, BlcC mit 4,4 \u00c2\u00b14,2 % ?-Helix und 32,4 \u00c2\u00b10,7 % ?-Faltblatt) charakterisiert. Bei der Bestimmung der spezifischen Aktivit\u00c3\u00a4t mit Pyranin als pH-Indikator und mit Hilfe des Reporterstammes A. tumefaciens NTL4 (pCF218)(pCF372) im ONPG- und X-Gal-Assay zeigte sich BlcC stets um einen Faktor von 2 bis 3 aktiver als AiiB.<\/p>\n
In der mikrobiologischen Bewertung wurde f\u00c3\u00bcr AiiB und BlcC eine Reduzierung der Biofilmbildung, gemessen durch die metabolische Aktivit\u00c3\u00a4t und die Biofilmmasse, von P. aeruginosa, P. pseudoalcaligenes, P. fluorescens, E. aerogenes und C. violaceum nachgewiesen. Sie besa\u00c3\u0178en jedoch keinen Einfluss auf Bakterien, die nicht \u00c3\u00bcber AHL kommunizieren, wie S. lutea, E. coli, P. mirabilis und die QS-defizienten Mutanten von E. coli und C. violaceum. Neben der Biofilmbildung in P. aeruginosa reduzierten AiiB und BlcC auch dessen Virulenzfaktoren wie Pyocyanin, Pyoverdin, Pyochelin und Rhamnolipide. In C. violaceum verminderte sich in Anwesenheit von AiiB und BlcC die Bildung von Violacein signifikant um 18 %. Weiterhin st\u00c3\u00b6rten AiiB und BlcC das Schwimm- und Schwarmverhalten von P. aeruginosa und P. mirabilis.<\/p>\n
Die Immobilisierung \u00c3\u00bcber Physisorption und Chemisorption sowie durch den Einschluss in eine polymere Matrix wurde zun\u00c3\u00a4chst mit Hilfe von Modellenzymen erarbeitet und auf ihre Eignung untersucht. Zur Immobilisierung \u00c3\u00bcber Physisorption wurden verschiedene polymere und anorganische Partikel ausgew\u00c3\u00a4hlt und charakterisiert. Der pH-Wert des Immobi-lisierungspuffers und die spezifische BET-Oberfl\u00c3\u00a4che der Partikel besa\u00c3\u0178en den gr\u00c3\u00b6\u00c3\u0178ten Einfluss auf die Immobilisierung von Enzymen. Das Desorptionsverhalten der physi-sorbierten Enzyme variierte in Abh\u00c3\u00a4ngigkeit der zugrundeliegenden physikalischen Wechselwirkungskr\u00c3\u00a4fte. Es zeigte sich jedoch, dass 50 bis 90 % des gesamten physisorbierten Enzyms innerhalb der ersten 24 Stunden desorbierten. Lediglich die Immobilisierung \u00c3\u00bcber ionische Wechselwirkungen f\u00c3\u00bchrte zu einer verz\u00c3\u00b6gerten Freisetzung.<\/p>\n
Siliziumsubstrate, welche \u00c3\u00bcber eine Silanisierung aus der Fl\u00c3\u00bcssigphase, mit COOH- beziehungsweise NH2-Gruppen ausger\u00c3\u00bcstet wurden, dienten zur chemisorptiven Anbindung von AHL-Lactonasen. Es wurden hier Belegungsdichten von 330 – 630 funktionellen Gruppen\/nm2 erzielt. Eine Freisetzung des immobilisierten Enzyms ist hier per Definition nicht m\u00c3\u00b6glich und wurde folglich nicht untersucht.
Hydrogele, basierend auf Poly(ethylenglykol)diacrylat, mit Polymergehalten zwischen 25 und 50 % wurden als Depotsystem hergestellt. Sie zeigten eine moderate Quellung von 200 % und waren in ihrer Maschenweite von 4,4 bis 7,1 nm \u00c3\u00bcber den Polymeranteil ein-gestellt. Bei einer Deformation < 1 % verhielten sich die Hydrogele wie weiche visko-elas-tische Feststoffe und wiesen mit zunehmendem Polymeranteil eine h\u00c3\u00b6here, mechanische Sta-bilit\u00c3\u00a4t auf. Die UV-Einwirkung w\u00c3\u00a4hrend der Netzwerkbildung besa\u00c3\u0178 weder auf die Sekun-d\u00c3\u00a4rstruktur noch auf die spezifische Aktivit\u00c3\u00a4t von Enzymen einen gravierenden negativen Einfluss. Durch eine geeignete Kombination der Maschenweite und des hydrodynamischen Radius des Proteins wurde ein Ausbluten des Hydrogels in der Anfangsphase vermieden und eine gleichm\u00c3\u00a4\u00c3\u0178ige Freisetzung von aktivem Enzym \u00c3\u00bcber eine Dauer von 14 Tagen erreicht.<\/p>\n
Letztlich wurden AHL-Lactonasen mit geeigneten Methoden immobilisiert und ihre Biofilm-reduzierende Wirkung auf P. aeruginosa PAO1 untersucht. AiiB und BlcC, welche auf Kalksodaglask\u00c3\u00bcgelchen und Siliziumdioxidpartikeln immobilisiert wurden, reduzierten die Biofilmbildung und die Produktion von Virulenzfaktoren signifikant, wohingegen sich Polystyrolacryls\u00c3\u00a4urepartikel f\u00c3\u00bcr diese Anwendung als ungeeignet herausstellten. AHL-Lactonasen, welche \u00c3\u00bcber ihr Tag an Maltose immobilisiert wurden, reduzierten zwar die Biofilmbildung, jedoch nicht statistisch signifikant. AiiB und BlcC, welche kovalent \u00c3\u00bcber ihren N-Terminus gebunden wurden, f\u00c3\u00bchrten zur einer reduzierten Biofilmbildung und einer verminderten Produktion von Virulenzfaktoren. Auch ein Einschluss von AiiB und BlcC in einem Hydrogel verminderte die Bildung von Virulenzfaktoren und des Biofilms nach 16 h und nach 88 h.<\/p>\n
Mit dieser Arbeit wurden die Voraussetzungen geschaffen, die f\u00c3\u00bcr einen industriellen Einsatz von AHL-Lactonasen im Einsatz gegen Biofilme bisher fehlten: Zun\u00c3\u00a4chst wurde anhand verschiedener Bakterienspezies systematisch gezeigt, dass sie als biofilmvermeidende Wirk-stoffe in das QS Gram-negativer Baktrien eingreifen und das Biofilmwachstum und die Virulenzfaktorbildung reduzieren. Das hier entwickelten Herstellungsverfahren erm\u00c3\u00b6glicht ein weiteres Upscaling zur gro\u00c3\u0178technischen Herstellung der AHL-Lactonasen, um deren kommerzielle Verf\u00c3\u00bcgbarkeit zu erm\u00c3\u00b6glichen. Letzlich wurden beispielhaft Immobili-sierungsans\u00c3\u00a4tze gezeigt, die nach ihrer Weiterentwicklung, in technischen wasserf\u00c3\u00bchrenden Systemen eingesetzt werden k\u00c3\u00b6nnen.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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