Nutzung von Naturstrategien zur Vermeidung von Biofilmen an Oberfl\u00e4chen<\/p>\n
Biofilme am falschen Ort oder mit pathogenen Keimen verursachen volkswirtschaftliche Sch\u00e4den und sind gesundheitsgef\u00e4hrdend. H\u00e4ufig angewandte Bek\u00e4mpfungsstrategien sind in ihrer Anwendung und Effektivit\u00e4t eingeschr\u00e4nkt: Biofilme k\u00f6nnen oftmals nicht vollst\u00e4ndig entfernt werden oder bilden Resistenzen gegen\u00fcber den eingesetzten Chemikalien, welche zudem oft stark toxisch und hochkorrosiv sind.<\/p>\n
Bakterien k\u00f6nnen in Abh\u00e4ngigkeit von der Populationsdichte ihr Verhalten \u00fcber extrazellul\u00e4re Signalmolek\u00fcle steuern (Quorum Sensing, QS). So wird eine Vielzahl an bakteriellen Verhaltensweisen wie die Biofilmbildung und die Expression von Virulenzfaktoren reguliert, die durch eine St\u00f6rung der Zell-Zell-Kommunikation beeinflusst werden k\u00f6nnen. Typische Strategien zur Bek\u00e4mpfung der Biofilmbildung Gram-negativer Organismen \u00fcber das QS beinhalten die kompetitive Inhibition des Signalmolek\u00fclrezeptors durch ein Strukturanalogon und den enzymatischen Abbau des Signalmolek\u00fcls N-Acylhomoserinlacton (AHL).<\/p>\n
Grundvoraussetzungen f\u00fcr den praktischen Einsatz eines biofilmreduzierenden Wirkstoffes sind seine Verf\u00fcgbarkeit und seine Wirkung, idealerweise mit einem breiten Wirkspektrum, sowie ferner seine Darreichungsform, beispielsweise als Oberfl\u00e4chenbeschichtung oder in Form einer Formulierung. Die Wirkung von AHL-Lactonasen auf die Biofilmbildung und die Produktion von Virulenzfaktoren sind in der Literatur beschrieben als Untersuchungen, in denen entsprechende Gensequenzen, vor allem aiia, in die untersuchte Zielspezies kloniert und das Verhalten dieser Mutanten mit ihren jeweiligen Wildtypen verglichen wurden. Diese Art der Wirkungsbestimmung wurde angewandt, da AHL-Lactonasen derzeit nicht kommerziell verf\u00fcgbar sind. Die Expression der AHL-Lactonasen erfolgte in bisherigen Studien vor allem mit Escherichia coli im Sch\u00fcttelkolbenma\u00dfstab mit geringen Ausbeuten von bis zu 54 mg\/L, um die Struktur von AiiA und AiiB aufzukl\u00e4ren und ihre Aktivit\u00e4t zu bestimmen.<\/p>\n
Ziel dieser Arbeit war es in das QS Gram-negativer Bakterien einzugreifen, um deren Biofilmwachstum zu hemmen und die Bildung von Virulenzfaktoren zu reduzieren Dar\u00fcber hinaus wurde das Potential von AHL-Lactonasen, beispielhaft an AiiA, AiiB und BlcC (ehemals AttM), als antibakterielle Wirkstoffe ermittelt. Um dies zu erreichen, wurden die AHL-Lactonasen AiiA, AiiB und BlcC zun\u00e4chst in E. coli in einem 7 L-Bioreaktor exprimiert und \u00fcber chromatographische Methoden aufgereinigt. Anschlie\u00dfend wurde ihre Wirkung auf das QS anhand der Biofilmbildung und der Produktion unterschiedlicher Virulenzfaktoren an ausgew\u00e4hlten Gram-negativen Bakterienst\u00e4mmen untersucht. F\u00fcr einen praktischen industriellen Einsatz wurden sie zur Demonstration der Machbarkeit an Partikeloberfl\u00e4chen und mit Maltose ausger\u00fcsteten Flachsubstraten physisorbiert, an COOH- und NH2-funktionalisierten Oberfl\u00e4chen gebunden sowie in ein Hydrogel eingeschlossen. Auch diese Oberfl\u00e4chenbeschichtungen und Formulierungen wurden auf ihre Biofilm-reduzierenden Eigenschaften analysiert.<\/p>\n
Zun\u00e4chst wurden AiiA, AiiB und BlcC in einer Hochzelldichtefermentation mit bis zu 1,2 g\/L exprimiert und auf eine Reinheit von 99 % aufgereinigt. Anschlie\u00dfend wurden die mit MALDI-TOF verifizierten AHL-Lactonasen AiiB und BlcC hinsichtlich ihrer hydro-dynamischen Radien (2,42 \u00b10,12 nm f\u00fcr AiiB und 2,37 \u00b1 0,12 nm f\u00fcr BlcC), ihrer iso-elektrischen Punkte (5,45 f\u00fcr AiiB und 5,75 f\u00fcr BlcC) und ihrer Sekund\u00e4rstruktur (AiiB mit 11,4 \u00b12,2 % ?-Helix und 36,2 \u00b12,9 % ?-Faltblatt, BlcC mit 4,4 \u00b14,2 % ?-Helix und 32,4 \u00b10,7 % ?-Faltblatt) charakterisiert. Bei der Bestimmung der spezifischen Aktivit\u00e4t mit Pyranin als pH-Indikator und mit Hilfe des Reporterstammes A. tumefaciens NTL4 (pCF218)(pCF372) im ONPG- und X-Gal-Assay zeigte sich BlcC stets um einen Faktor von 2 bis 3 aktiver als AiiB.<\/p>\n
In der mikrobiologischen Bewertung wurde f\u00fcr AiiB und BlcC eine Reduzierung der Biofilmbildung, gemessen durch die metabolische Aktivit\u00e4t und die Biofilmmasse, von P. aeruginosa, P. pseudoalcaligenes, P. fluorescens, E. aerogenes und C. violaceum nachgewiesen. Sie besa\u00dfen jedoch keinen Einfluss auf Bakterien, die nicht \u00fcber AHL kommunizieren, wie S. lutea, E. coli, P. mirabilis und die QS-defizienten Mutanten von E. coli und C. violaceum. Neben der Biofilmbildung in P. aeruginosa reduzierten AiiB und BlcC auch dessen Virulenzfaktoren wie Pyocyanin, Pyoverdin, Pyochelin und Rhamnolipide. In C. violaceum verminderte sich in Anwesenheit von AiiB und BlcC die Bildung von Violacein signifikant um 18 %. Weiterhin st\u00f6rten AiiB und BlcC das Schwimm- und Schwarmverhalten von P. aeruginosa und P. mirabilis.<\/p>\n
Die Immobilisierung \u00fcber Physisorption und Chemisorption sowie durch den Einschluss in eine polymere Matrix wurde zun\u00e4chst mit Hilfe von Modellenzymen erarbeitet und auf ihre Eignung untersucht. Zur Immobilisierung \u00fcber Physisorption wurden verschiedene polymere und anorganische Partikel ausgew\u00e4hlt und charakterisiert. Der pH-Wert des Immobi-lisierungspuffers und die spezifische BET-Oberfl\u00e4che der Partikel besa\u00dfen den gr\u00f6\u00dften Einfluss auf die Immobilisierung von Enzymen. Das Desorptionsverhalten der physi-sorbierten Enzyme variierte in Abh\u00e4ngigkeit der zugrundeliegenden physikalischen Wechselwirkungskr\u00e4fte. Es zeigte sich jedoch, dass 50 bis 90 % des gesamten physisorbierten Enzyms innerhalb der ersten 24 Stunden desorbierten. Lediglich die Immobilisierung \u00fcber ionische Wechselwirkungen f\u00fchrte zu einer verz\u00f6gerten Freisetzung.<\/p>\n
Siliziumsubstrate, welche \u00fcber eine Silanisierung aus der Fl\u00fcssigphase, mit COOH- beziehungsweise NH2-Gruppen ausger\u00fcstet wurden, dienten zur chemisorptiven Anbindung von AHL-Lactonasen. Es wurden hier Belegungsdichten von 330 – 630 funktionellen Gruppen\/nm2 erzielt. Eine Freisetzung des immobilisierten Enzyms ist hier per Definition nicht m\u00f6glich und wurde folglich nicht untersucht.
Hydrogele, basierend auf Poly(ethylenglykol)diacrylat, mit Polymergehalten zwischen 25 und 50 % wurden als Depotsystem hergestellt. Sie zeigten eine moderate Quellung von 200 % und waren in ihrer Maschenweite von 4,4 bis 7,1 nm \u00fcber den Polymeranteil ein-gestellt. Bei einer Deformation < 1 % verhielten sich die Hydrogele wie weiche visko-elas-tische Feststoffe und wiesen mit zunehmendem Polymeranteil eine h\u00f6here, mechanische Sta-bilit\u00e4t auf. Die UV-Einwirkung w\u00e4hrend der Netzwerkbildung besa\u00df weder auf die Sekun-d\u00e4rstruktur noch auf die spezifische Aktivit\u00e4t von Enzymen einen gravierenden negativen Einfluss. Durch eine geeignete Kombination der Maschenweite und des hydrodynamischen Radius des Proteins wurde ein Ausbluten des Hydrogels in der Anfangsphase vermieden und eine gleichm\u00e4\u00dfige Freisetzung von aktivem Enzym \u00fcber eine Dauer von 14 Tagen erreicht.<\/p>\n
Letztlich wurden AHL-Lactonasen mit geeigneten Methoden immobilisiert und ihre Biofilm-reduzierende Wirkung auf P. aeruginosa PAO1 untersucht. AiiB und BlcC, welche auf Kalksodaglask\u00fcgelchen und Siliziumdioxidpartikeln immobilisiert wurden, reduzierten die Biofilmbildung und die Produktion von Virulenzfaktoren signifikant, wohingegen sich Polystyrolacryls\u00e4urepartikel f\u00fcr diese Anwendung als ungeeignet herausstellten. AHL-Lactonasen, welche \u00fcber ihr Tag an Maltose immobilisiert wurden, reduzierten zwar die Biofilmbildung, jedoch nicht statistisch signifikant. AiiB und BlcC, welche kovalent \u00fcber ihren N-Terminus gebunden wurden, f\u00fchrten zur einer reduzierten Biofilmbildung und einer verminderten Produktion von Virulenzfaktoren. Auch ein Einschluss von AiiB und BlcC in einem Hydrogel verminderte die Bildung von Virulenzfaktoren und des Biofilms nach 16 h und nach 88 h.<\/p>\n
Mit dieser Arbeit wurden die Voraussetzungen geschaffen, die f\u00fcr einen industriellen Einsatz von AHL-Lactonasen im Einsatz gegen Biofilme bisher fehlten: Zun\u00e4chst wurde anhand verschiedener Bakterienspezies systematisch gezeigt, dass sie als biofilmvermeidende Wirk-stoffe in das QS Gram-negativer Baktrien eingreifen und das Biofilmwachstum und die Virulenzfaktorbildung reduzieren. Das hier entwickelten Herstellungsverfahren erm\u00f6glicht ein weiteres Upscaling zur gro\u00dftechnischen Herstellung der AHL-Lactonasen, um deren kommerzielle Verf\u00fcgbarkeit zu erm\u00f6glichen. Letzlich wurden beispielhaft Immobili-sierungsans\u00e4tze gezeigt, die nach ihrer Weiterentwicklung, in technischen wasserf\u00fchrenden Systemen eingesetzt werden k\u00f6nnen.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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