Protein-Bioengineering pflanzlicher Polyphenoloxidasen (PPOs)<\/p>\n
Effizienter, wirtschaftlicher, nachhaltiger- das sind nur einige der Gr\u00fcnde daf\u00fcr, dass immer mehr rein chemische industrielle Verfahren durch den Einsatz sogenannter Biokatalysatoren ersetzt werden. W\u00e4hrend einer k\u00fcrzlich in unserer Arbeitsgruppe durchgef\u00fchrten Doktorarbeit zu Struktur-Funktions-Beziehungen von L\u00f6wenzahn-Polyphenoloxidasen (PPOs) gelang M. Dirks-Hofmeister die Identifizierung und Isolierung von elf PPO-Isoenzymen aus dem Gew\u00f6hnlichen L\u00f6wenzahn. Bei PPOs (EC 1.10.3.1) handelt es sich um Kupfer-haltige Oxidoreduktasen, die mit Hilfe von molekularem Sauerstoff die Oxidation von ortho<\/em>-Diphenolen zu den entsprechenden ortho<\/em>-Chinonen katalysieren. W\u00e4hrend reiner Sauerstoff in chemischen Prozessen auf Grund seiner sehr hohen Reaktivit\u00e4t ein gro\u00dfes Risiko darstellt, sind oxidative Enzyme von Natur aus darauf spezialisiert, Sauerstoff gefahrlos umzusetzen. Neben der Entdeckung, dass verschiedene PPO-Isoenzyme unterschiedliche Substratspektren aufweisen, gelang Dirks-Hofmeister mit der erfolgreichen heterologen Expression der pflanzlichen PPOs in Escherichia coli <\/em>ein entscheidender Fortschritt im Hinblick auf die industrielle Nutzbarkeit dieser Enzyme. Protein-Bioengineering pflanzlicher Polyphenoloxidasen (PPOs) Effizienter, wirtschaftlicher, nachhaltiger- das sind nur einige der Gr\u00fcnde daf\u00fcr, dass immer mehr rein chemische industrielle Verfahren durch den Einsatz sogenannter Biokatalysatoren ersetzt werden. W\u00e4hrend einer k\u00fcrzlich in unserer Arbeitsgruppe durchgef\u00fchrten Doktorarbeit zu Struktur-Funktions-Beziehungen von L\u00f6wenzahn-Polyphenoloxidasen (PPOs) gelang M. Dirks-Hofmeister die Identifizierung und Isolierung von elf PPO-Isoenzymen aus dem Gew\u00f6hnlichen L\u00f6wenzahn. […]<\/p>\n","protected":false},"author":1,"featured_media":0,"template":"","meta":{"footnotes":""},"categories":[],"tags":[2477],"class_list":["post-52592","promotionsstipendium","type-promotionsstipendium","status-publish","hentry","tag-deutschland"],"meta_box":{"dbu_stipendiaten_az":"20014\/319","dbu_stipendiaten_anrede":"","dbu_stipendiaten_nachname":"Prexler","dbu_stipendiaten_vorname":"Sarah","dbu_stipendiaten_titel":"Dr.","dbu_stipendiaten_fbeginn":"2014-07-01 00:00:00","dbu_stipendiaten_fende":"2017-06-30 00:00:00","dbu_stipendiaten_e_anschrif":"Westf\u00e4lische Wilhelms-Universit\u00e4t M\u00fcnster
Durch die Etablierung der Expression von L\u00f6wenzahn-PPOs in E. coli <\/em>er\u00f6ffnet sich mir jetzt die M\u00f6glichkeit, durch Aminos\u00e4ureaustausche gezielt\u00a0 PPO-Varianten mit definierten Substratspezifit\u00e4ten f\u00fcr den Einsatz als Biokatalysatoren zu erstellen. Um weitere Anwendungsm\u00f6glichkeiten f\u00fcr diese hochinteressanten Enzyme aufzudecken, sollen au\u00dferdem mittels eines pull-downs <\/em>aus L\u00f6wenzahn-Extrakten nat\u00fcrliche Substrate der PPOs identifiziert werden.
Zu Beginn des Projekts sollen bioinformatische Sequenzanalysen sowie in silico<\/em>-Strukturmodellierungen zur Identifizierung von Aminos\u00e4uren (AS) f\u00fchren, die durch ihre 3D-Lage im aktiven Zentrum der PPOs essentiell f\u00fcr Aktivit\u00e4t und Substratspezifit\u00e4t des Enzyms sind. Die identifizierten AS sollen dann mit Hilfe degenerierter Primer in einer Polymerasekettenreaktion gegen eine Auswahl anderer AS ausgetauscht werden. Durch Expression der ver\u00e4nderten PPOs in E. coli <\/em>entsteht eine sogenannte fokussierte Protein-Bibliothek, die mit Hilfe von Modellsubstraten auf PPO-Aktivit\u00e4t gescreent werden soll. Auf diese Weise entdeckte PPO-Varianten mit neuen Substratspezifit\u00e4ten sollen aufgereinigt, biochemisch charakterisiert und schlie\u00dflich f\u00fcr Kinetik-Messungen zur Bestimmung von kcat, KM sowie der katalytischen Effizienz eingesetzt werden. Diese gr\u00fcndliche biochemische Typisierung legt den Grundstein f\u00fcr eine industrielle Nutzung der PPOs mit speziellen Substratspezifit\u00e4ten als Biokatalysatoren.
Das Substrate-pull<\/em>–down<\/em> soll mit Hilfe sogenannter loss-of-function <\/em>(lof<\/em>)-PPOs erfolgen, die zwar in der Lage sind, Substrate im aktiven Zentrum zu binden, jedoch nicht, sie umzusetzen. Dazu sollen basierend auf bioinformatischen Analysen AS derart ausgetauscht werden, dass keine Katalyse mehr stattfinden kann, die 3D-Struktur des aktiven Zentrums jedoch unver\u00e4ndert bleibt. Die lof<\/em>-PPOs sollen mit phenolhaltigen Extrakten aus verschiedenen L\u00f6wenzahn-Organen bzw. dem Latex inkubiert werden. Nach der Co-Aufreinigung von lof<\/em>-Mutanten und gebundenen Substraten m\u00fcssen die Enzyme denaturiert und aus dem Ansatz entfernt werden, um die \u201egefischten\u201c Substrate durch eine reversed phase<\/em>-Chromatographie aufzutrennen. Die weitere Identifizierung der pflanzlichen PPO-Substrate soll mit Hilfe des Massenspektrometers erfolgen, \u00fcber das die AG Moerschbacher seit einigen Monaten verf\u00fcgt. Die neu gewonnenen Substrate sollen zu Kinetik-Messungen sowie in silico<\/em>–docking<\/em>-Studien verwendet werden, auf deren Grundlage nach zeitlicher M\u00f6glichkeit weitere neue effiziente PPO-Varianten erstellt werden sollen.
Die Entwicklung von PPO-Varianten mit definierten Substratspezifit\u00e4ten sowie die Ausdehnung der Einsatzm\u00f6glichkeiten dieser Biokatalysatoren durch ein erweitertes bekanntes Substratspektrum ist ein weiterer innovativer Schritt auf dem Weg hin zu einer biobasierten Wirtschaft.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
Institut f\u00fcr Biochemie und Biotechnologie der Pflanzen
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