Biosynthesis and biological significance of the cyanobacterial metabolites Ambigol A and B<\/p>\n
Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine neue Technik zur Klonierung und Expression von Naturstoff-Biosynthese-Genclustern (BGCs) mitentwickelt und um eine einfache, mRNA-unabh\u00e4ngige Methode zur Kontrolle auf vollst\u00e4ndige Gentranskription direkt w\u00e4hrend der heterologen Expression erweitert. Direct Pathway Cloning (DiPaC) erm\u00f6glicht die Integration kleiner bis mittelgro\u00dfer Gencluster direkt in f\u00fcr die heterologe Expression geeignete Vektoren. Die entsprechende DNA-Sequenz kann schon w\u00e4hrend dieses Prozesses modifiziert werden, beispielsweise durch Addition, Austausch oder Deletion genomischer Regulatoren wie Promotoren und Terminatoren, oder durch das Vertauschen der Reihenfolge einzelner Gene. Die Eignung von DiPaC zur Klonierung anspruchsvoller Sekund\u00e4rmetabolit-BGCs wurde anhand dreier Beispiele demonstriert.<\/p>\n
Die cyanobakteriellen, hexapeptidischen Anabaenopeptine sind Proteaseinhibitoren, welche in verschiedenen Varianten von mehreren Cyanobakterien synthetisiert werden. Nostoc punctiforme<\/em> PCC 73102 stellt die beiden L-Homophenylalanin (L-Hph) und L-Homotyrosin (L-Hty) enthaltenden Varianten Anabaenopeptin NZ857 und Nostamide A her, welche auf dem 29,2 kb gro\u00dfen apt<\/em> Gencluster codiert sind. Die f\u00fcr die Homoaminos\u00e4ure-Biosynthese verantwortlichen Gene befinden sich up- und downstream der zentralen nichtribosomalen Peptidsynthetase-(NRPS)Einheit, welche aus vier Genen besteht und f\u00fcr den Aufbau und die Zyklisierung des finalen Produkts verantwortlich ist. Unter Verwendung von DiPaC konnte das apt<\/em> BGC aufgeteilt und in zwei verschiedene Expressionsplasmide integriert werden. Dadurch war eine unabh\u00e4ngige Expressionsinduktion der Vorstufen-synthetisierenden Enzyme und anschlie\u00dfend der assemblierenden NRPS-Maschinerie m\u00f6glich. Diese Strategie f\u00fchrte zur ersten erfolgreichen Produktion von Anabaenopeptin NZ857 und Nostamide A in dem hetererologen Expressionsstamm Escherichia coli<\/em> BAP1.<\/p>\n Sodorifen ist eine volatile organische Verbindung (VOC) mit bisher unbekannter biologischer Aktivit\u00e4t, welche von verschiedenen Serratia plymuthica<\/em> St\u00e4mmen produziert wird. S. plymuthica<\/em> WS3236 enth\u00e4lt ein potentielles, 4,6 kb gro\u00dfes Sodorifen-Cluster (sod<\/em>), welches mit DiPaC kloniert und anschlie\u00dfend durch heterologe Expression in E. coli<\/em> BL21 verifiziert wurde. Gleichzeitig wurde ein erfolgreiches Transkriptions-Reportersystem entwickelt, welches auf dem C<\/em>-terminal angef\u00fcgten, gr\u00fcn fluoreszierenden Protein (GFP) basiert. Durch Variation der Kultivierungsbedingungen konnte eine 26-fach h\u00f6here, heterologe Sodorifenproduktion im Vergleich zum Wildtyp-Stamm erzielt werden, wobei die Reinheit der Substanz im Rohextrakt bei \u00fcber 90% lag.<\/p>\n Ambigole sind polychlorierte Naturstoffe, welche von Fischerella ambigua<\/em> 108b synthetisiert werden. Sie weisen interessante antibakterielle, antimykotische und zytotoxische Aktivit\u00e4ten auf. Bisher wurden drei Derivate, Ambigol A-C, beschrieben. Sie bestehen aus drei Dichlorphenol-Einheiten, welche \u00fcber Biaryl- und Biaryletherbindung verkn\u00fcpft sind und weisen ungew\u00f6hnliche Bindungskonnektivit\u00e4ten auf. Die beiden Chloratome an der zentralen Phenol-Einheit von Ambigol A und B befinden sich in relativer meta <\/em>Position. Bei Ambigol C liegen die Biaryletherbindungen, welche die drei Phenole miteinander verbinden, in relativer meta<\/em> Position zur Hydroxygruppe des zentralen Phenols vor. Bisher ist keine enzymatische Reaktion bekannt, welche entweder die Biarylbindungen oder die Chloratome in diesen Positionen erkl\u00e4ren konnte. Daher wurde die Ambigol-Biosynthese im Rahmen dieser Arbeit auf mehreren Ebenen untersucht.<\/p>\n Die vorangegangene, bioinformatische Identifikation des potentiellen, 14,3 kb gro\u00dfen Ambigol (ab<\/em>) BGCs in F. ambigua<\/em> wurde auf Basis neuester genomischer Datens\u00e4tze aktualisiert. Die Identit\u00e4t des ab<\/em> Clusters wurde durch heterologe Expression in dem cyanobakteriellen Wirtssystem Synechococcus elongatus<\/em> PCC 7942 best\u00e4tigt. Die zur nat\u00fcrlichen Transformation von Cyanobakterien verwendete Methode musste hierf\u00fcr weiter entwickelt werden, da die Integration derart langer DNA-Fragmente in das Genom von Synechococcus<\/em> bisher nicht beschrieben wurde. Unter Verwendung von DiPaC konnte, durch das Halbieren des ab<\/em> Clusters und die aufeinanderfolgende Integration beider Teile in verschiedene neutrale Stellen innerhalb des Chromosoms von S. elongatus<\/em>, erfolgreich eine Doppelmutante erstellt werden, welche mindestens ein Ambigol-Derivat synthetisiert. Das ab<\/em> Cluster enth\u00e4lt die beiden Cytochrom P450 Enzyme Ab2 und Ab3, von welchen anzunehmen ist, dass sie f\u00fcr die Installation aller Biaryl- und Biaryletherbindungen in den Ambigolen verantwortlich sind. Die enzymatische Reaktivit\u00e4t beider Proteine wurden mithilfe verschiedener Ans\u00e4tze charakterisiert. Im Anschluss an die heterologe Expression in E. coli<\/em> BL21 und die darauf folgende Reinigung wurden in vitro<\/em> Assays mit dem potentiellen Substrat 2,4-Dichlorphenol (2,4-DCP) durchgef\u00fchrt. Die Strukturen der Reaktionsprodukte wurden durch Vergleiche mit chemisch synthetisierten Standards aufgekl\u00e4rt. Ab2 katalysiert die Bildung eines Biarylether-verkn\u00fcpften Dimers, w\u00e4hrend Ab3 haupts\u00e4chlich ein Biaryl-verbr\u00fccktes Dimer bildet. Beide beobachteten Produkte enthalten die neu gekn\u00fcpften Bindungen in \u00fcblicher ortho <\/em>Position relativ zur Hydroxygruppe. Diese Ergebnisse wurden durch in vivo <\/em>2,4-DCP-Feedingassays mit Ab2 und\/oder Ab3-exprimierenden, heterologen E. coli<\/em> und S. elongatus<\/em> St\u00e4mmen best\u00e4tigt.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":" Biosynthesis and biological significance of the cyanobacterial metabolites Ambigol A and B Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine neue Technik zur Klonierung und Expression von Naturstoff-Biosynthese-Genclustern (BGCs) mitentwickelt und um eine einfache, mRNA-unabh\u00e4ngige Methode zur Kontrolle auf vollst\u00e4ndige Gentranskription direkt w\u00e4hrend der heterologen Expression erweitert. 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