Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Traditionelle chemische Verfahren f\u00fcr stereoselektive Epoxidierungen oder Hydroxylierungen basieren auf Schwermetallkatalysatoren. Biokatalytische Oxygenierung stellt daher eine \u00f6konomisch sowie \u00f6kologisch interessante Alternative dar. Entsprechende Biokatalysatoren sind jedoch stark limitiert durch Substrat- und Produktinhibition. Dies erfordert eine integrierte, effektive und kosteng\u00fcnstige Abtrennung von Produkten aus Reaktionsgemischen. Der bisherige Emulsionsprozess zur stereospezifischen Styrolepo-xidierung erlaubt dies nur in nicht kontinuierlicher Betriebsweise. Aus \u00f6konomischen sowie \u00f6kologischen Gr\u00fcnden erfordert die industrielle Anwendung aber zumindest eine halbkontinuierliche Prozessf\u00fchrung sowie hohe Produktivit\u00e4t. Dies wird durch effektive R\u00fcckextraktion der Produkte aus der Emulsion (innovative Membran- und scCO2-technologien) sowie durch hohe Aktivit\u00e4t und Langzeitstabilit\u00e4t des Biokatalysators (in vivo Kofaktorregenerierung, Enzymstabilit\u00e4t) angestrebt.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenF\u00fcr Biotransformationen im Zweiphasensystem mit Bis-(2-ethylhexyl)phthalat als organischer Phase wurden wachsende sowie ruhende (nicht wachsende) rekombinante, Styrolmonooxygenase (StyAB) exprimierende E. coli eingesetzt. Diese wurden in kontinuierlicher Kultur sowie im Satz- und Zulaufverfahren kultiviert. Aktivit\u00e4tsbestimmungen fanden in rein w\u00e4ssrigem Puffer mit ruhenden Zellen oder Zellextrakt statt. Zur Erh\u00f6hung des Reduktasegehalts wurde eine zweite Kopie des Reduktasegens (styB) in den Expressionsvektor kloniert. F\u00fcr die Begasung wurden hochpor\u00f6se keramische Rohr- und Hohlfasermembranen sowie Membranmodule entwickelt. Daf\u00fcr wurde die Best\u00e4ndigkeit der Einklebungen der Membranen untersucht. Die Porengr\u00f6\u00dfenverteilungen wurde mittels Bubble-point und Flow-pore Methode bestimmt. Zum Einsatz in Extraktionsmodulen wurden keramische Hohlfasermembranen mit selektiven Polymeren (PDMS, Teflon) beschichtet. Die Membranen wurden mittels REM-Aufnahmen und Gasselektivit\u00e4tstests sowie \u00fcber Flussbestimmungen charakterisiert und kontrolliert. Um die M\u00f6glichkeit der Produktextraktion mit \u00fcberkritischem CO2 aus BEHP oder der Emulsion zu evaluieren, wurden sowohl SFE (Supercritical Fluid Extraction) als auch SFC (Supercritical Fluid Chromatography) eingesetzt.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Oxygenasen katalysieren unter milden Bedingungen industriell interessante hoch spezifische Oxyfunktionalisierungen. Limitationen finden sich h\u00e4ufig in den Bereichen Substrat- und Produktinhibition, Sauerstofftransfer, Enzymstabilit\u00e4t, und Kofaktorregeneration. Hier wird die Charakterisierung und Optimierung eines Emulsionsprozesses zur enantioselektiven Styrolepoxidierung, die auf Styrolmonooxygenase enthaltenden rekombinanten E. coli beruht, beschrieben. Bis-(2-ethylhexyl)phthalat (BEHP) wurde dabei als organische Phase zur Produktextraktion benutzt. F\u00fcr die Prozessf\u00fchrung wurden kontinuierliche Kultivation inklusive Metabolismusbetrachtungen und das Zulaufverfahren evaluiert, wobei NADH-Limitation bzw. Produkttoxizit\u00e4t als Hauptlimitationen gefunden wurden. Basierend auf dem Zulaufverfahren wurde ein semikontinuierliches repeated fed-batch-Verfahren mit einer durchschnittlichen Produktivit\u00e4t von 5.3 g\/Ltot\/h entwickelt. Durch Erh\u00f6hung der Reduktaseexpression und Untersuchungen mit wachsenden wie auch nicht wachsenden, ruhenden Zellen im Ein- und Zweiphasensystem wurde gefunden, dass weder Massentransfer noch intrinsische Enzymstabilit\u00e4t limitierend waren, obwohl sich die Reduktase als relativ instabil erwies. Die zeitliche Abnahme der spezifischen Aktivit\u00e4t ruhender Zellen war ebenfalls aber nicht ausschlie\u00dflich durch Produktinhibition bedingt. Zur Produktabtrennung aus der Emulsion und Begasung wurden l\u00f6sungsmittelbest\u00e4ndige Membranen und Membranmodule entwickelt. Diesbez\u00fcglich stehen nun keramische Hohlfasermembranen mit unterschiedlichen Porenweiten (20 nm bis 1400 nm) und dampfsterilisierbare Module aus Edelstahl mit austauschbaren Membranelementen (Fl\u00e4che 0.05 m\u00b2 bis 5 m\u00b2) zur Verf\u00fcgung. Alternativ k\u00f6nnen die Membranen neuerdings auch vollkeramisch ausgef\u00fchrt werden. F\u00fcr die Begasung erwiesen sich die Hohlfasermembranen als sehr effizient und erm\u00f6glichten eine bis zu 13-fache Steigerung des Saustoffeintrags – einer Hauptlimitation beim Scale-Up. F\u00fcr die selektive Produktabtrennung wurden die keramischen Hohlfasermembranen mit Polydimethylsiloxan (PDMS) sowie einem perfluorierten Polymer (Teflon) beschichtet. Erstere war besser geeignet f\u00fcr die Pervaporation, letztere f\u00fcr die Pertraktion. Trotz viel versprechender Resultate konnten die f\u00fcr den Bioprozess ben\u00f6tigten Produktextraktionsraten noch nicht erreicht werden. F\u00fcr die in Zukunft angestrebte Optimierung der Membranmodule bieten vor allem Supportunterstruktur und Beschichtung der Membranen sowie eine Vergr\u00f6-\u00dferung der Membranfl\u00e4che gro\u00dfes Potenzial. Derartige Konzepte f\u00fcr l\u00f6semittelbest\u00e4ndige Membranen, die f\u00fcr Pertraktion wie auch Pervaporation genutzt werden k\u00f6nnen, sind bisher unbekannt und stellen ei-ne viel versprechende innovative Neuentwicklung dar. Trennversuche mit einem modifizierten SFE-Verfahren (Extraktion mit scCO2) bei variablen Dr\u00fccken und Temperaturen zeigten, dass Styrol und Styroloxid problemlos aus BEHP sowie der Emulsion extrahiert werden k\u00f6nnen. Des Weiteren konnten Styrol und Styroloxid mittels Chromatographie mit scCO2 (SFC) und Kieselgel-basierter Festphase vonein-ander getrennt werden. In Zukunft soll die Kopplung von Biotransformation, Membrantechnologie und scCO2-Technologie die Produktion von chiralen Epoxiden in einem nachhaltigen integrierten Prozess er-lauben.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Innerhalb des Projekts generierte Toxizit\u00e4tsdaten sind in einen wissenschaftlichen Artikel eingeflossen, der an die Zeitschrift Applied and Environmental Microbiology geschickt wurde. Eine weitere Publikation \u00fcber Metabolismusbetrachtungen bei katalytisch aktiven Zellen ist in Arbeit. Bez\u00fcglich den Eigenschaften ruhender Zellen sowie der Begasung und Produktextraktion \u00fcber keramische Membranen sind weitere Publikationen in Fachzeitschriften geplant. \u00dcber limitierende Faktoren in der oxidativen Biokatalyse mit wachsenden wie auch ruhenden Zellen im Zweiphasensystem wurde in Manchester (Biocatalysis in non-conventional media; 13.\/14.4.05) eine Pr\u00e4sentation mit dem Titel Whole-Cell Bio-oxidationin a Two-Liquid Phase System. What are the Limiting Factors? gegeben.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Im Rahmen des Projekts wurde ein semikontinuierliches Verfahren zur biokatalytischen Epoxidation von Styrol zu (S)-Styroloxid entwickelt und optimiert, wobei hohe Produktivit\u00e4ten erreicht wurden. Biokatalysator-Engineering sowie der Einsatz ruhender Zellen ergaben interessante Einblicke in Massentransfer, Biokatalysatoraktivit\u00e4t und -stabilit\u00e4t sowie Produktinhibition. Um die Hauptlimitationen Produkttoxizit\u00e4t und – auf technischem Ma\u00dfstab – Sauerstofftransfer zu umgehen, wurden keramische Membranen und Membranmodule entwickelt. Die Begasungseffizienz konnte mittels Keramikmembranen bis um das 13-Fache gesteigert werden. Stofftransportuntersuchungen ergaben, dass vor allem die mit Pertraktion aber auch die mit Pervaporation erreichten Produktextraktionsraten noch zu niedrig waren, um die Verfahren erfolgreich an die Biotransformation zu koppeln. Zudem wurde gezeigt, dass Styroloxid mit Trenntechnologien in \u00fcberkritischem CO2 effizient aus BEHP extrahiert und aufkonzentriert werden kann. In einem weiteren von der DBU finanzierten auf den vorliegenden Ergebnissen aufbauenden Projekt soll das hier erkannte hohe Entwicklungspotenzial der Membran- und scCO2-technologien ausgenutzt und die Bioka-talyse \u00fcber 13C-Flussanalyse charakterisiert werden. Dies wird die Entwicklung nachhaltiger Bio-Oxyfunktionalisierungsprozesse erlauben.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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