Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Die Behandlung der Mortellaro\u0092schen Krankheit (lat. Dermatitis digitalis, DD), einer Bakterieninfektion durch Treponema die urs\u00e4chlich ist f\u00fcr starke R\u00fcckg\u00e4nge in der Milchleistung von Rindern, f\u00fchrt heute entweder zu einem hoher Eintrag von Antibiotika in die Umwelt, mit den Folgen m\u00f6glicher Resistenzbildungen, oder dem Einbringen entsprechend giftiger Substanzen, verbunden mit der Notwendigkeit diese zu entsorgen. Ziel des Projekts ist die Entwicklung spezifisch antimikrobiell wirkender Proteine (s. g. Artilysin\u00aee) gegen Treponema, die im Gegensatz zu den bisher angewendeten Verfahren umweltfreundlich und biologisch abbaubar sind, um so die Umwelt zu schonen.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenZu Beginn des Projektes wurden geeignete Treponema-St\u00e4mme ausgew\u00e4hlt und kultiviert. Die Gattung Treponema besteht aus einer Reihe Gram-negativer Bakterien, deren Membran ungew\u00f6hnlich aufgebaut ist und eine hohe Stabilit\u00e4t aufweist. Da aus anderen Projekten bereits eine umfangreiche Bibliothek an Artilysin\u00aeen bestand, wurden diese als Ausgangsbasis f\u00fcr erste Tests ausgew\u00e4hlt. Aufgrund des ungew\u00f6hnlichen Aufbaus der Zelloberfl\u00e4che von Treponema mussten im Rahmen des Projektes neue Artilysin\u00aee entwickelt werden. D. h., es wurden gezielt Phagen (bzw. deren DNA) bioinformatisch analysiert, um neue Endolysine zu identifizieren, die dann zu Artilysin\u00aeen weiterentwickelt wurden. Die Wirkung der Artilysin\u00aee auf die Erreger wurde in umfangreichen antimikrobiellen Screenings untersucht.
\nAufgrund der anspruchsvollen Wachstumsbedingungen der Treponema Bakterien mussten erhebliche zus\u00e4tzliche Anstrengungen unternommen werden, um die geeigneten Aktivit\u00e4tstestungen durchf\u00fchren zu k\u00f6nnen. Aus diesem Grund musste auch die Laufzeit des Projektes verl\u00e4ngert werden.
\nAlle bisherigen Standardtestverfahren f\u00fcr Artilysin\u00aee, wie MIC-Testung, Plattentestung oder photometrische Lysetests, funktionierten nicht. Daher mussten nochmals Alternativen gesucht werden und weitere Testverfahren charakterisiert und neu etabliert werden.
\nBei der Mikrokalorimetrie werden das Wachstum bzw. die Wachstumsinhibition \u00fcber die W\u00e4rmeentwicklung (\u00b5W) detektiert. An der Charit\u00e9 in Berlin wurde dies bereits mit anderen Spirochaeten (Borrelien) durchgef\u00fchrt. Dadurch konnten Probleme durch die deutlich geringere Zelldichte, die in Fl\u00fcssigkultur erreicht wird, ausgeglichen werden.<\/p>\n
Im Zuge der Entwicklungsarbeiten konnte ein stabiles Verfahren f\u00fcr eine Aktivit\u00e4tstestung auf der Basis der Mikrokalorimetrie etabliert werden. Aufgrund der aufgetretenen Verz\u00f6gerungen mussten insbesondere Teile der Formulierungsentwicklung und die Durchf\u00fchrung der Applikationsversuche auf die Zeit nach Projektende verschoben werden. Sie werden dann von Lisando auf eigene Kosten durchgef\u00fchrt. <\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Im Verlauf des Projektes konnten folgende Meilensteine erfolgreich erreicht werden:
\n1. Aufbau einer Stammsammlung bei Lisando, die repr\u00e4sentativ die wichtigsten Treponema Spezies umfasst, die bei Dermatitis Digitalis des Rindes von Bedeutung sind.
\n2. Entwicklung von Kultivierungsbedingungen und weitere Optimierung zur Erh\u00f6hung der Bakteriendichte in Kultur. Letzteres war von entscheidender Bedeutung zur Entwicklung geeigneter Assays f\u00fcr die Testung antibakterieller Substanzen.
\n3. Aufgrund der speziellen Wachstumsanforderungen von Treponema-Spezies konnten Standardverfahren zur Testung der enzymatischen Aktivit\u00e4t und der antibakteriellen Aktivit\u00e4t nicht zur Charakterisierung von Artilysinen auf Treponema-Spezies eingesetzt werden. Da das Peptidoglykan von Treponema sp. und anderen Gram-negativen Bakterien fast identisch ist, wurden von Treponema abgeleitete Endolysine auf Zellwandpr\u00e4parationen von P.aeruginosa getestet. Um die Aktivit\u00e4t von Artilysinen gegen Treponema zu charakterisieren mussten neue Assays etabliert werden: Ein Resazurin-basierter Makrodilutionstest und ein Test mit Hilfe der isothermalen Mikrokalorimetrie erlaubten beide eine sensitive und genaue Messung der antibakteriellen Aktivit\u00e4t vergleichbar zu Standardtests der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC).
\n4. Von acht Endolysinen (6 Treponema-spezifische, 2 von anderen Spiroch\u00e4ten) die durch weitergehende Recherchen in wissenschaftlicher Literatur und entsprechenden Datenbanken identifiziert werden konnten, wurden sieben erfolgreich exprimiert und vier davon zeigten enzymatische Aktivit\u00e4t. Diese vier Treponema-spezifischen und enzymatisch aktiven Endolysine wurden als Bausteine f\u00fcr die Entwicklung von 47 einzigartigen Treponema-spezifischen Artilysin\u00aeen genutzt. Diese wurden parallel zu 16 Artilysin\u00aeen aus der \u0093Lisando Artilysin Toolbox\u0094 f\u00fcr Gram-negative Bakterien weiter getestet.
\n5. Zwei Artilysin\u00aee, das Treponema-spezifische Art-CB16 und Art-CB11 aus der \u0093Lisando Artilysin Toolbox\u0094, zeigten gute antibakterielle Aktivit\u00e4t gegen T.denticola DSM 14222, wie Tests mit isothermaler Mikrokalorimetrie belegen. <\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
\u00dcber das Projekt und die erreichten Fortschritte wurde regelm\u00e4\u00dfig in den von der Deutschen Bundesstiftung Umwelt durchgef\u00fchrten Veranstaltungen berichtet.
\nSomit wurde das Fachpublikum \u00fcber den aktuellen Entwicklungsstand auf dem Laufenden gehalten. Im Zuge der weiteren Arbeiten werden derzeit intensive Gespr\u00e4che mit potenziellen Industriepartnern gef\u00fchrt. Die weitere Produktumsetzung wird dann von einer intensiven \u00d6ffentlichkeitsarbeit begleitet werden, um den neuen Ansatz der Behandlung von Dermatitis digitales einer breiteren \u00d6ffentlichkeit zug\u00e4nglich zu machen.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Die zwei gefundenen Artilysin\u00ae-Leitmolek\u00fcle (Art-CB11 und Art-CB16) werden derzeit weiter in vitro gegen andere Treponema Spezies getestet, um ihr Aktivit\u00e4tsspektrum gegen diese Bakterien zu analysieren. Dar\u00fcber hinaus werden beide Artilysin\u00ae derzeit einem breiten Pufferscreening unterzogen, um geeignete Formulierungsbedingungen zu entwickeln die eine stabile Langzeitlagerung und maximale Aktivit\u00e4t f\u00fcr die Anwendung in vivo erm\u00f6glichen. Basierend auf bereits etablierten Kontakten ist der n\u00e4chste Schritt dann eine Testung beider Leit-Artilysin\u00aee in einem in vivo Modell f\u00fcr Dermatitis Digitalis beim Rind.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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