Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Ziel des Gesamtprojektes (Phase 1 und Phase 2) ist die Entwicklung eines nachhaltigen Produktionsverfahrens f\u00fcr Rhamnolipide mit Hilfe eines nicht-pathogenen Bakteriums als Katalysator und umweltscho-nender Produktaufarbeitung. Dabei zielt das Projekt durch B\u00fcndelung der Expertisen beginnend bei der Stammkonstruktion, \u00fcber die Optimierung von St\u00e4mmen und Verfahrenstechniken bis hin zum Scale-Up und der Entwicklung alternativer Produktaufarbeitungstechniken direkt auf einen Transfer von Technolo-gie der akademischen Partner hin zu den Industriepartnern ab.
\nDurch balancierte Expression der relevanten Biosynthese Gene\/ Operons aus P. aeruginosa im nicht-pathogenen Stamm P. putida, der sich durch eine hohe Toleranz gegen\u00fcber dem Rhamnolipid als Produkt auszeichnet, soll dessen Produktivit\u00e4t gesteigert werden. Hierzu wurde in Kooperation mit der Firma Evocatal ein neues System zur Konstruktion und nachfolgenden Durchmusterung von Bibliotheken synthetischer Promotoren entwickelt. Dieses innovative Promoter-Trap-System basiert auf den neuartigen evoglow Reporterproteinen und wurde bereits genutzt, um eine Promotorbank zu erzeugen, die nunmehr in Kooperation getestet wird. Hierzu wurde die Parallelkultivierung rekombinanter P. putida im BioLector-System erfolgreich etabliert und die Technik genutzt, um die Toleranz der St\u00e4mme gegen\u00fcber hohen Produkttitern und die Kompatibilit\u00e4t des verwendeten Antibiotikums zu best\u00e4tigen. Ferner wurde gezeigt, dass die Schaumbildung keine Limitierung f\u00fcr den Einsatz des Systems darstellt. Somit steht bereits jetzt die notwendige Hochdurchsatzmethodik zur Isolierung geeigneter Promotoren zur Verf\u00fcgung. Durch Analyse des metabolischen Netzwerks konnte in einem ersten erfolgreichen Schritt das Potential des Stammes f\u00fcr eine metabolische Optimierung gezeigt werden. Hierbei wurde die Rhamnolipidproduktion durch Verwendung einer Mutante des um Vorl\u00e4ufermolek\u00fcle konkurrierenden Stoffwechselweges zur Synthese von Polyhydroxyalkanoaten (PHAs) um den Faktor 3,5 gesteigert werden. Ferner wurde eine Entkopplung von Zellwachstum und Rhamnolipidproduktion gezeigt, die eine vereinfachte Optimierung der Leistungsf\u00e4higkeit des Wirtsmetabolismus und des genetischen Konstrukts zur Rhamnolipidproduktion erlauben wird. In Up-scaling-Versuchen wurde die rekombinante Produktion von Rhamnolipiden erfolgreich im 50-Liter-Ma\u00dfstab durchgef\u00fchrt. Es zeigte sich, dass das gezielte Aussch\u00e4umen des Produkts eine Anreicherung um ca. den Faktor 100 erbringen kann, was eine interessante Option zur Verbesserung der Reinigung im Sinne der Umweltfreundlichkeit darstellt. Der Test von Adsorbentien verlief ebenso vielversprechend wie erste Versuche zur Reinigung von Monorhamnolipiden. Die Produktion von Rhamnolipiden war ferner unter Verwendung von Glukose in Mineralmedium m\u00f6glich. Die technischen Daten f\u00fcr einen Vergleich des bisherigen Prozesses mit den bereits verf\u00fcgbaren Parametern des hier entwickelten Prozesses unter Gesichtspunkten der Umwelteffizienz wurden bereits gesammelt und kommuniziert – sie werden in einer sp\u00e4teren Projektphase Grundlage einer entsprechenden Analyse in Kooperation mit dem Institut f\u00fcr Umweltinformatik sein.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten Methoden-\tOptimierung von Expressionsraten durch Entwicklung synthetischer Promotoren in Kombination mit real time PCR, biochemischer Bestimmung der Produktkonzentration und Messung von Reportergenfusionen
\n–\tOptimierung der Kulturbedingungen durch Parallelfermentation mit der BioLector-Technologie
\n–\tEntwicklung und Vergleich von Reinigungsverfahren; Adsorption und Desorption, Aussch\u00e4umung und Kristallisation
\n–\tGenerierung stabiler Produktionsst\u00e4mme durch Generierung synthetischer Operonstrukturen und Integration in das Chromosom
\n–\tPilotproduktion von Rhamnolipid<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Durch ausgewogene (Ko-)Expression der relevanten Biosynthese Gene\/Operons aus P.aeruginosa im nicht-pathogenen Stamm P. putida, der sich durch eine hohe Toleranz gegen\u00fcber dem Rhamnolipid als Produkt auszeichnet, soll dessen Produktivit\u00e4t gesteigert werden. Hierzu wurde ein neues System zur Konstruktion von Bibliotheken synthetischer Promotoren entwickelt. Die Durchmusterung von ca. 80.000 Klonen ergab Promotor-Konstrukte mit unterschiedlichen Promotorst\u00e4rken, von denen die besten die Produktion von Rhamnolipiden mehr als vervierfachten. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass sich die Rhamnolipidproduktion bei h\u00f6heren Temperaturen verbessert. Um diesen Effekt im Detail untersuchen zu k\u00f6nnen, wurde ein Inkubationsger\u00e4t entwickelt, dass die Erzeugung eines Temperaturgradienten \u00fcber eine Mikrotiterplatte zur Kultivierung von St\u00e4mmen und somit ein Temperatur-Screening erlauben wird. Die Parallelkultivierung rekombinanter P. putida im BioLector-System wurde erfolgreich etabliert und die Technik genutzt, um die Toleranz der St\u00e4mme gegen\u00fcber hohen Produkttitern und die Kompatibilit\u00e4t des verwendeten Antibiotikums zu best\u00e4tigen. Ferner wurde gezeigt, dass die Schaumbildung keine Limitierung f\u00fcr den Einsatz des Systems darstellt. Somit steht bereits jetzt die notwendige Hochdurchsatzmethodik zur Isolierung geeigneter Promotoren zur Verf\u00fcgung. Es wurde erfolgreich eine Produktion bei Kultivierung in Mineralmedium mit Glukose als Kohlenstoffquelle durchgef\u00fchrt. Zur Optimierung des Mediums wurde eine Design of Experiments-Software etabliert, die in Kombination mit einem automatisierten BioLector-System durchgef\u00fchrt werden soll. Die rekombinante Produktion von Rhamnolipiden wurde erfolgreich im 50-Liter-Ma\u00dfstab durchgef\u00fchrt. Es zeigte sich, dass das gezielte Aussch\u00e4u-men des Produkts eine Anreicherung um ca. den Faktor 100 erbringen kann. Der Test von Adsorbentien und entsprechenden L\u00f6sungsmitteln verlief ebenso vielversprechend wie erste Versuche zur Reinigung von Monorhamnolipiden. Ebenso wurde eine MPLC-Reinigung etabliert und Rhamnolipidstandards hergestellt. In ersten Anwendungstests wurden Rhamnolipide als vielversprechend im Vergleich zu den etablierten APG-Tensiden f\u00fcr kosmetische Zwecke identifiziert. Parallel wurden Konstrukte hergestellt und erfolgreich getestet, die die rekombinante Produktion von Di-Rhamnolipiden als zweites Produkt er-lauben. Derzeit wird ein erster echter Produktionsstamm konstruiert, der alle bisherig als zielf\u00fchrend identifizierten Merkmale in sich vereint und diese vermittelt durch ein neu etabliertes Transposon-System stabil in seinem Genom integriert tragen wird.
\nDie technischen Daten f\u00fcr den Vergleich des Benchmark-Prozesses zur Rhamnolipidproduktion und die bereits verf\u00fcgbaren Parameter des hier entwickelten Prozesses wurden sukzessive gesammelt und kommuniziert – sie sind derzeit in einer entsprechenden Analyse der Umwelteffizienz, die in Kooperation mit dem Institut f\u00fcr Umweltinformatik durchgef\u00fchrt wird.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Publikationen:
\n\tWittgens A, Tiso T, Arndt TT, Wenk P, Hemmerich J, M\u00fcller C, Wichmann R, K\u00fcpper B, Zwick M, Wilhelm S, Hausmann R, Syldatk C, Rosenau F and Blank LM (2011). Growth independent rhamno-lipid production from glucose using the non-pathogenic Pseudomonas putida KT2440. Microbial Cell Factories Vol. 10(80)<\/p>\n
Poster
\n\tWittgens A, Blank LM, Santiago-Schuebel B, Wilhelm S, Rosenau F (2011). Production of rhamno-lipids in Pseudomonas putida by heterologous expression of rhl-genes from Pseudomonas aeru-ginosa PA01. VAAM, Karlsruhe, Germany<\/p>\n
\tTiso T, Wittgens A, Arndt TT, Rosenau F, Blank LM (2011).Rhamnolipid Synthesis from Glucose with Engineered Pseudomonas putida .BioTrends, Dortmund, Germany
\n\tSantiago-Sch\u00fcbel B, Wittgens A, Wilhelm S, Rosenau F, Hofmann D (2011). Production of rhamno-lipids in Pseudomonas putida. DGMS, Dortmund, Germany
\n\tK\u00fcpper B, Lesik A, Mause A, del Amor Villa EM, Wichmann R (2011) Isolation and Purification of fermentative produced mono-rhamnolipid BioTrends, Dortmund, Germany
\n\tK\u00fcpper B, Lesik A, del Amor Villa EM, Wichmann R (2011) Isolation and Purification of Fermenta-tive Produced Mono-Rhamnolipids ECAB, Berlin, Germany<\/p>\n
Patente<\/p>\n
\tMeans and methods for rhamnolipid production
\n\tFoam Adsorption – EP 11 192 918.8<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Das Projekt Umweltschonende Herstellung und Aufreinigung von Biotensiden (Rhamnolipiden) mit dem nicht-pathogenen Bakterium Pseudomonas putida wurde inhaltlich als Ganzes positiv vorbegutachtet. Aus organisatorischen Gr\u00fcnden wurde seitens der DBU nachtr\u00e4glich eine Unterteilung des Projektes in zwei Phasen vorgeschlagen. W\u00e4hrend dieser ersten Phase von Phase 1 haben die Projektpartner bereits entscheidende Resultate erzielt. Diese sind begr\u00fcndet in intensiven Kooperationen innerhalb des Konsortiums und sind durch den exzellent funktionierenden Transfer von Methodik, Materialien und Informationen bedingt. Ebenso konnten erste Publikationen und Patente gemeinsam erfolgreich eingereicht werden, dies teilweise unter Einbindung aller Partner, was wiederum f\u00fcr die besondere Qualit\u00e4t der Gemeinsamkeit spricht. Somit sind die Voraussetzungen f\u00fcr eine erfolgreiche Bearbeitung der gesamten Phase 2 erf\u00fcllt, die dann zu dem beabsichtigten und projektierten industriellen Verfahren f\u00fchren wird.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
Zielsetzung und Anlass des Vorhabens Ziel des Gesamtprojektes (Phase 1 und Phase 2) ist die Entwicklung eines nachhaltigen Produktionsverfahrens f\u00fcr Rhamnolipide mit Hilfe eines nicht-pathogenen Bakteriums als Katalysator und umweltscho-nender Produktaufarbeitung. Dabei zielt das Projekt durch B\u00fcndelung der Expertisen beginnend bei der Stammkonstruktion, \u00fcber die Optimierung von St\u00e4mmen und Verfahrenstechniken bis hin zum Scale-Up und […]<\/p>\n","protected":false},"author":1,"featured_media":0,"template":"","meta":{"footnotes":""},"categories":[],"tags":[47,65,51,52,53],"class_list":["post-25294","projektdatenbank","type-projektdatenbank","status-publish","hentry","tag-klimaschutz","tag-nordrhein-westfalen","tag-ressourcenschonung","tag-umweltforschung","tag-umwelttechnik"],"meta_box":{"dbu_projektdatenbank_az_ges":"13235\/01","dbu_projektdatenbank_medien":"","dbu_projektdatenbank_pdfdatei":"A-13235.pdf","dbu_projektdatenbank_bsumme":"262.384,00","dbu_projektdatenbank_firma":"Heinrich-Heine-Universit\u00e4t D\u00fcsseldorf\nInstitut f\u00fcr Molekulare Enzymtechnologie\nam Forschungszentrum J\u00fclich","dbu_projektdatenbank_strasse":"Stetternicher Forst","dbu_projektdatenbank_plz_str":"52426","dbu_projektdatenbank_ort_str":"J\u00fclich","dbu_projektdatenbank_p_von":"2010-02-15 00:00:00","dbu_projektdatenbank_p_bis":"2010-11-14 00:00:00","dbu_projektdatenbank_laufzeit":"9 Monate","dbu_projektdatenbank_telefon":"02461-612947","dbu_projektdatenbank_inet":"","dbu_projektdatenbank_bundesland":"Nordrhein-Westfalen","dbu_projektdatenbank_foerderber":"122","dbu_projektdatenbank_ab_bericht":"DBU-Abschlussbericht-AZ-13235_01.pdf","dbu_projektdatenbank_ist_nachbewilligung_von":"","dbu_projektdatenbank_hat_nachbewilligung":"","dbu_headerimage_cover":"","dbu_submenu":"","dbu_submenu_position":"","dbu_submenu_entry":[]},"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank\/25294","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/types\/projektdatenbank"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/users\/1"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank\/25294\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":38297,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank\/25294\/revisions\/38297"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=25294"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=25294"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=25294"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}