Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Eine bislang nur unzureichend in der Chemie genutzte Gruppe von Biokatalysatoren sind oxidative Enzyme, obwohl diese es erlauben molekularen Sauerstoff direkt als Cosubstrat zu verwenden und so die Herstellung hochinteressanter funktionalisierter Zwischenstufen bzw. von Endprodukten meist aus nicht-aktivierten Ausgangsverbindungen erlauben. Dies geht weit \u00fcber die Synthesem\u00f6glichkeiten der Chemie hinaus. Zus\u00e4tzlich kann bei biokatalytischen Verfahren auf die Verwendung toxischer bzw. explosiver Oxidationsmittel verzichtet werden. Hauptgr\u00fcnde f\u00fcr den bisher unzureichenden Einsatz oxidativer Enzyme in der Chemie sind: mangelnde Zahl an verf\u00fcgbaren Enzymen, problematische Expression, zu niedrige Aktivit\u00e4t, ineffizientes Cofaktorrecycling und Defizite in der verfahrenstechnischen Umsetzung bzw. in der Aufarbeitung.
\nDiese Probleme sollen in diesem Vorhaben durch einen interdisziplin\u00e4ren Ansatz gel\u00f6st werden, bei dem Expertisen aus einer ganzen Reihe von Fachgebieten (Mikrobiologie, Molekularbiologie (insbesondere Expressionssysteme), Proteinengineering, Organische Chemie, Fermentationstechnik, Technische Chemie) geb\u00fcndelt werden, um effiziente Plattformen zur Herstellung von Chemikalien mittels oxidativer Enzyme zu erm\u00f6glichen.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenProjektpartner I (UG)
\n–\tKlonierung von BVMO-Genen in Expressionsvektoren
\n–\tAffinit\u00e4tschromatographische Reinigung von BVMOs mittels \u00c4kta\u00ae-Purifier
\n–\tEtablierung eines Cofaktorrecyclingsystems (Phosphit-Dehydrogenase)
\n–\tChemische Synthese von 4-Hydroxyphenylethanoat
\n–\tGaschromatographische Trennung der Produkte von 4-Hydroxyacetophenon
\n–\tEntwicklung\/Anwendung von HTS-Assays zur Bestimmung der Aktivit\u00e4t und Regioselektivit\u00e4t
\n–\tMethoden der Zufallsmutagenese (error prone PCR; Megawhop PCR)
\n–\tKultivierung und Zellaufschluss im deep-well-MTP-Format
\nProjektpartner II (UE bzw. UB)
\n–\tHPLC, u.a. Anwendung einer Nucleodur\u00aeHilic- und Hypercarb-S\u00e4ule
\n–\t1H-NMR-Spektroskopie; 13C-NMR-Spektroskopie; UV\/VIS-Spektrophotometrie
\n–\tCharakterisierung von Biokatalysatoren (insb. Enzymaktivit\u00e4t)
\n–\tPr\u00e4parative Durchf\u00fchrung von Biotransformationen im Laborma\u00dfstab
\n–\tAufarbeitung von Reaktionsmischungen (Zentrifugation, Ultrafiltration, Extraktion)
\nProjektpartner III (TUHH)
\n–\tChirale HPLC-Analytik von cyclischen Ketonen und Lactonen
\n–\tUV-spektroskopische Bestimmung von enzymkinetischen Parametern
\n–\tChemische Synthesen unter Stickstoff
\n–\tRektifikation\/Destillation von Lactonen und Ketonen
\n–\tEntwicklung von Membranreaktoren zur Begasung von Enzymreaktoren
\n–\tEnzymkinetische Untersuchungen im Hohlfaserreaktor
\nProjektpartner IV (UR)
\n–\tBestimmung des Verteilungskoeffizienten von ?-Caprolacton in verschiedenen organischen L\u00f6sungsmitteln und Untersuchung des Einflusses von Puffersalzen auf das Extraktionsverhalten
\n–\tAufarbeitung von Stamml\u00f6sungen (10 g\/L Edukt\/Produkt) und Realproben (Fermentationsbr\u00fche) –\tProduktcharakterisierung mittels Karl-Fischer-Titration, NMR und GC-Analytik
\n–\tVerdr\u00e4ngungsversuch mit kontinuierlicher Substratabnahme\/Produktzunahme zur Simulation einer \tFermentation mit Adsorbereinsatz (in situ SFPR-Konzept)
\n–\tHPLC-Analytik – Methode analog zur UF
\n–\tReaktionsans\u00e4tze und online O2-Verfolgung
\nProjektpartner V (TUD)
\n–\tAktivit\u00e4tsassays mit ruhenden Zellen
\n–\tStandard Klonierungstechniken
\n–\tAufbau und Betrieb des tubul\u00e4ren Mikroreaktorsystems (siehe Anhang)
\nProjektpartner VI (UF)
\n–\tKlonierung von Prolinhydroxylase-Genen in Expressionsvektoren
\n–\tEnzymisolierung \u00fcber His6-tag
\n–\tSDS-PAGE, Aktivit\u00e4tstests mittels HPLC- und Farbassay
\n–\tKultivierung von E. coli und Ganzzellbiokatalyse
\n–\tIonenaustauschchromatographie
\n–\tgerichtete Mutagenese (QuikChange)
\n–\tFluoreszenz-HPLC-Chromatographie; 1H-NMR- und 13C-NMR-Spektroskopie
\nProjektpartner VII (UA)
\n–\tGen-Klonierung durch Phosphorothioate-based ligase-independent gene cloning
\n–\tExpression von rekombinanten Proteinen in Sch\u00fcttelkolben und im MTP-Format
\n–\tProteinanalyse\/ Quantifizierung: SDS-PAGE, CO-Differenzspektroskopie, Enzymaktivit\u00e4tstests
\n–\tIonenaustauschchromatographie zur Proteinaufreinigung
\n–\tBiokatalyse in vitro und im Ganzzellsystem
\n–\tGaschromatographische Trennung der Produkte
\n–\tPolarimetrie zur Ermittlung von chiralen Substanzen (Enantiomere)
\n–\tFermentation (5-10 L-Ma\u00dfstab)
\n–\tDurchmusterungssysteme: NADPH-Nachweissystem; ABTS-Assay
\n–\tMutagenesemethoden: ortsgerichtete S\u00e4ttigungsmutagenese; epPCR; Megawhop PCR
\nProjektpartner XIII (HHUD)
\n–\tVerschiedene Screeningmethoden (Anreicherungs-Screening, in silico-Screening)
\n–\tMikrobiologische Standardmethoden der Mikroorganismen-Kultivierung
\n–\tFermentation im 40 L-Ma\u00dfstab
\n–\tHochzelldichtefermentation
\n–\tMutagenese durch error-prone-PCR
\n–\tPCR; Klonierung unter Verwendung von E. coli als Wirt
\n–\tProteinexpression
\n–\tPhotometrische Enzymaktivit\u00e4tstests; SDS-PAGE
\n–\tProteinreinigung mittels FPLC (\u00c4kta)
\nProjektpartner IX (BRAIN)
\n–\tKlonierung verschiedener prokaryotischer BVMO-kodierender Gene
\n–\tSequenzierung der Gene, bioinformatische Analyse der Sequenzen
\n–\tKlonierung in Expressionsvektoren f\u00fcr S. albus bzw. S. lividans und E. coli
\n–\tRekombinante Expression der BVMOs in S. albus bzw. S. lividans und E. coli
\n–\tAufreinigung bzw. Aufkonzentrierung von BVMOs
\n–\tAktivit\u00e4tsbestimmungen mittels spektroskopischer und GC\/MS-Analytik
\n–\tBiotranformationen mit BVMO-Ganzzellkatalysatoren im 1 L Ma\u00dfstab
\nProjektpartner X (Enzymicals AG)
\n–\tProteinexpression im 20 L-Ma\u00dfstab (Fermenter)
\n–\tZellaufschluss mittels Hochdruckhomogenisator bzw. Ultraschall
\n–\tGefriertrocknung\/Spr\u00fchtrocknung
\n–\tBiokatalysen im Ganzzellsystem
\n–\tExtraktion aus Biokatalyse\u00fcberstand<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Teilprojekt I: P450- und BVMOs zur Herstellung von Bulk- und Feinchemikalien
\nUniversit\u00e4t Greifswald (UG, Prof. Bornscheuer)
\nDurch Codon-Optimierung des Gens der 4-Hydroxyacetophenon-Monooxygenase aus P. putida JD1 (HAPMO), Anpassung der Klonierungsstrategie und \u00dcberarbeitung des Kultivierungsprotokolls konnte die funktionelle Expression und Aufreinigung deutlich verbessert werden. Weiterhin wurde durch epPCR eine Zufallsmutantenbibliothek sowohl der HAPMO als auch der Cyclohexanon-Monooxygenase aus A-cinetobacter calcoaceticus (CHMO) generiert, deren vielversprechendste Varianten genauer untersucht wurden. Eine S\u00e4ttigungsmutantenbibliothek der HAPMO wurde ebenfalls angelegt. Zudem wurden zwei Hochdurchsatz-Assaysysteme zur Analyse der Aktivit\u00e4t bzw. Regioselektivit\u00e4t von BVMOs entwickelt. Es konnten drei neue BVMOs aus P. putida NCIMB rekombinant hergestellt und charakterisiert werden. Die biotechnologische Anwendbarkeit der zwei neuen Enzyme, die zur Subklasse II der BVMOs geh\u00f6ren, wurde durch die Kopplung mit einer Flavin-Reduktase aus E. coli verbessert.
\nUniversit\u00e4t Erlangen-N\u00fcrnberg bzw. Universit\u00e4t Bielefeld (UE\/UB, Prof. Gr\u00f6ger)
\nDie P450-Monooxygenase-katalysierte Hydroxylierung wurde mit n-Oktan und n-Butan durchgef\u00fchrt unter Anwendung einer in situ-Cofaktorregenerierung mit einer Glucosedehydrogenase. Hierbei erwies sich die Reaktionsdurchf\u00fchrung mit n-Oktan bei 8\u00b0C f\u00fcr 8 h und erst anschlie\u00dfendem Erw\u00e4rmen auf Raumtemperatur als g\u00fcnstig. Zudem gelang auch die Hydroxylierung des Fl\u00fcssiggases n-Butan. In einem “Proof of Concept” wurde 2-Butanol hochregioselektiv mit einer Produktbildung von 170 mg\/L gebildet. Auch wurde die Oxidation von 2-Butanol mit einer ADH und einer NADH-Oxidase untersucht und hierbei Butanon mit 52% Ausbeute (Produktbildung: 2.2 g\/L) erhalten. Das Konzept der biokatalytischen Doppeloxidation wurde zudem erfolgreich f\u00fcr die Direktsynthese von ?-Caprolacton aus Cyclohexanol mittels einer BVMO und einer ADH sowie Sauerstoff demonstriert, wobei Ums\u00e4tze von bis zu 99% bzw. 94% bei Substratkonzentrationen von 20 mM bzw. 60 mM erhalten wurden. Bei einer weiteren Erh\u00f6hung der Substratkonzentration auf bis zu 100 mM nahm der Umsatz jedoch merklich ab, so dass im Folgenden die Inhibierung und die Stabilit\u00e4t der BVMO gegen\u00fcber Edukt (Cyclohexanol), Zwischenprodukt (Cyclo-hexanon) und Produkt (?-Caprolacton) untersucht wurde. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die bisher eingesetzte BVMO bei hohen Konzentrationen am Produkt Caprolakton so-wohl inhibiert als auch deaktiviert wird. Zus\u00e4tzlich zeigt sich aber auch in Abwesenheit dieser Komponenten eine Aktivit\u00e4tsabnahme der BVMO.
\nRWTH Aachen (UA, Prof. Schwaneberg)
\nMittels semi-rationalen Designs wurde eine Cytochrom P450 BM-3 Mutante erstellt, die mit zwei Mutationen (R255P\/P329H) eine erh\u00f6hte Aktivit\u00e4t gegen\u00fcber n Heptan, sowie eine signifikant ver\u00e4nderte Regio- und Enantioselektivit\u00e4t im Vergleich zum Wildtyp-Enzym zeigt. Die Oxidationsraten und Kopp-lungseffizienz der generierten P450 BM-3 Mutante, der Referenzvariante 19A12 und des Wildtyp-Enzyms wurden zur Charakterisierung bestimmt. Als Modellsubstrat wurde n-Heptan f\u00fcr mittel- bis kurzkettige Alkane verwendet. Daneben wurde das biokatalytische Konzept einer “one-pot” Doppeloxidation von n-Heptan sowohl in vitro als auch in vivo, mit der P450 BM-3 Monooxygenase und der Alkoholdehy-drogenase aus Rhodococus erythropolis untersucht. Um eine enzymgekoppelte Regenerierung des Cofaktors realisieren zu k\u00f6nnen, wurde durch gezielte Mutagenese die Cofaktorspezifit\u00e4t der P450 BM-3 von NADPH zu NADH ver\u00e4ndert. Der in vitro Ansatz mit aufgereinigtem Enzym erzielte eine maximale Produktkonzentration von 164 mg\/l. Eine Erweiterung des Systems auf ganze Zellen wurde durch Co-Expression beider Enzyme erfolgreich durchgef\u00fchrt und 162 mg\/L Produkt wurden gebildet.
\nBRAIN AG (BRAIN, Dr. Eck)
\nDas Ziel der Untersuchungen war die Evaluation von Streptomyces albus als Expressionsplattform f\u00fcr die Gewinnung von BVMO-Ganzzellkatalysatoren. Verschiedene Ma\u00dfnahmen, wie etwa die Optimierung der Transkription und Translation, f\u00fchrten in Kombination zu einer Steigerung der Protein-Ausbeute f\u00fcr einen BVMO-Katalysator. Allerdings konnte keine Steigerung der Aktivit\u00e4tsausbeute erzielt werden. Verschiedene Beobachtungen deuten darauf hin, dass eine starke Steigerung der BVMO-Aktivit\u00e4t f\u00fcr die Zellen nicht tolerabel ist. Daher erscheint die Nutzung von S. albus als Wirt zur Gewinnung dieser BVMO schwierig und eine weitere Optimierung im Vergleich zu einer E. coli-basierten Expression mit deutlich mehr Aufwand verbunden. In E. coli konnte dagegen die Aktivit\u00e4tsausbeute eines BVMO-Ganzzellkatalysators durch Fusion einer CHMO mit L\u00f6slichkeits-steigernden Proteinen deutlich verbessert werden, insbesondere durch Erh\u00f6hung der L\u00f6slichkeit in Gegenwart des Reaktionsprodukts Caprolacton, das ab einer Konzentration von 10 g\/l f\u00fcr eine Aggregation und Inaktivierung des Enzyms sorgte. Damit konnten die geplanten Ziele (Meilensteine) erreicht und durch die Steigerung der Aktivit\u00e4tsausbeute f\u00fcr die CHMO ein Beitrag zur Optimierung eines Biotransformations-Prozesses geliefert werden.
\nEnzymicals AG (EC, Dr. Menyes)
\nDie Enzymicals AG konnte die vorgesehenen Meilensteine M5 und M16 fristgerecht erreichen und hat im Rahmen der Kooperation Projektpartner mit BVMO-Pr\u00e4paraten versorgt. Die Expression der CHMO wurde im 20 L-Ma\u00dfstab etabliert und die erhaltene Biomasse in Biokatalysen im Ganzzellsystem ver-wendet, um Cyclohexanon zu ?-Caprolacton umzusetzen. Weiterhin wurden im Verlauf des Projektes verschiedene Additive in der Gefriertrocknung f\u00fcr die CHMO getestet, um f\u00fcr die Arbeit in Laboren akti-vere CHMO-Pr\u00e4parate zur Verf\u00fcgung stellen zu k\u00f6nnen. Des Weiteren wurden auch einzelne Schritte der Aufarbeitung der Ganzzellbiokatalyse betrachtet und optimiert, dazu geh\u00f6ren zum Beispiel die Beseitigung von nat\u00fcrlichen Bioemulgatoren und Untersuchungen zum in situ substrate feed and product re-moval (SFPR) mit Hilfe von Adsorberharzen.
\nSeSaM-Biotech GmbH (SeS, Dr. Behrendt)
\nDer Beitrag von SeSaM-Biotech im Rahmen des DBU-Antrages, war die Bereitstellung von hochqualitativen Mutantenbibliotheken f\u00fcr den Kooperationspartner RWTH Aachen. Diese wurden erstellt und dem Kooperationspartner zur weiteren Bearbeitung \u00fcbergeben.
\nTeilprojekt II: Prolinhydroxylasen zur Herstellung chiraler Bausteine
\nUniversit\u00e4t Freiburg (UF, Prof. M\u00fcller)
\nIn Teilprojekt II wurde die katalytische Aktivit\u00e4t der Prolinhydroxylasen mit Hilfe eines dazu entwickelten HPLC-Assays mit verschiedenen Substraten getestet sowie der Einfluss der Konzentration von Cofaktoren und Sauerstoff auf die Stabilit\u00e4t der Enzyme untersucht. Als \u00f6konomisch aussichtsreiche Produktionsmethode erwies sich die in vivo Biotransformation mit E. coli-Kulturen, die f\u00fcr eine Vielzahl von En-zym-Substrat-Kombinationen anwendbar ist. Dies wurde im Laborma\u00dfstab anhand der Synthese zweier synthetisch interessanter Bausteine (trans-5 Hydroxypipecolins\u00e4ure und trans-2,3-cis-3,4-Dihy-droxyprolin) demonstriert, deren chemische Synthese einen Vielstufenansatz erfordern w\u00fcrde.
\nTeilprojekt III: NADH-Oxidasen zur Herstellung von ?-Ketoglutars\u00e4ure
\nUniversit\u00e4t Erlangen-N\u00fcrnberg bzw. Universit\u00e4t Bielefeld (UE\/UB, Prof. Gr\u00f6ger)
\nDer Hauptfokus lag auf synthetischen Biotransformationen zur Synthese von ?-Ketoglutarat aus L-Glu-tamat mittels L-Glutamatdehydrogenasen (L-GluDH) und Sauerstoff als Oxidationsmittel sowie unter in situ-Cofaktorregenerierung des Cofaktors NAD+ mittels einer NADH-Oxidase. Nach Etablierung der Analytik zur Charakterisierung und Reaktionskontrolle sowie Untersuchungen zur Stabilit\u00e4t von ?-Ketoglutarat erfolgte u.a. die Untersuchung des Einflusses erh\u00f6hter Substratkonzentrationen. Hierbei zeigte sich eine Produktinhibierung bei pH 8. Aufgrund des positiven Einfluss hoher pH-Werte im Hinblick auf verminderte Produktinhibierungen bestand danach die Herausforderung darin, Biotransformationen bei hohen pH-Werten von pH 9-10 durchzuf\u00fchren. Zur Entwicklung eines auch bei h\u00f6heren pH-Werten stabilen Systems zur Cofaktorregenerierung wurde evaluiert, inwieweit “biomimetische” Metall-Komplexe die Funktion der NADH-Oxidase aus\u00fcben und damit als Ersatz f\u00fcr die bei hohen pH-Werten (in freier Form) instabile NADH-Oxidase eingesetzt werden k\u00f6nnen. Erstmalig konnte die Eignung eines Eisenporphyins als “artifizielles Enzym-Analoga” f\u00fcr die Bildung von ?-Ketoglutarat gezeigt werden (89% produktbezogener Umsatz bei pH 8), allerdings verliefen die Versuche bei pH-Werten (pH 9-10) nicht erfolgreich und ergaben niedrige Ums\u00e4tze. Demgegen\u00fcber gelang ein “proof of concept” f\u00fcr die Umsetzung von Glutamat zu dem ?-Ketoglutarat mittels einer L-GluDH bei erh\u00f6hten pH-Werten, indem eine NADH-Oxidase als Ganzzellkatalysator eingesetzt wurde. Dabei konnte bei 50 mM Substratkonzentration nach 24 h ein Produktbezogener Umsatz von 66% an ?-Ketoglutarat erzielt werden. Allerdings konnte insgesamt der Umsatz im Vergleich zu den Biotransformationen bei pH 8.0 nicht gesteigert werden. Dar\u00fcber hinaus wurde mit dem AK Prof. Hummel an einem alternativen Synthesezugang gearbeitet.
\nUniversit\u00e4t D\u00fcsseldorf (HHUD, Prof. Hummel)
\nF\u00fcr die enzymkatalysierte Herstellung von ?-Ketoglutarat durch oxidative Deaminierung von L-Glutamat wurden verschiedene enzymatische Wege vergleichend untersucht. Erste Versuche mit kommerziell verf\u00fcgbaren Glu-DH hatten gezeigt, dass diese Enzyme einer starken Produktinhibierung durch Ketoglutarat unterliegen. Ein umfangreiches Screening f\u00fchrte zu weiteren mikrobiellen Enzymen. Pr\u00e4parative Umsetzungen, die in Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis Prof. Gr\u00f6ger erfolgten, haben allerdings gezeigt, dass auch diese Enzyme einer zwar schw\u00e4cheren, aber weiterhin deutlichen Produktinhibierung bei h\u00f6heren pH-Werten deutlich schw\u00e4cher ist. So konnte die Aktivit\u00e4t der GluDH von Fusobacterium nuclea-tum in Gegenwart von Ketoglutarat von 52% Restaktivit\u00e4t bei pH 8 auf 94% bei pH 10 gesteigert werden. Eine pr\u00e4parative Anwendung der verf\u00fcgbaren GluDHs mit einem praktisch vollst\u00e4ndigen Umsatz war allerdings nicht m\u00f6glich, eine Produktinhibierung machte sich bereits in Umsetzungen von Glutamat-Konzentrationen >25 mM bemerkbar. Neben diesen detaillierten Untersuchungen mit mehreren GluDHs wurden weitere Enzymsysteme untersucht, dabei zeigte sich, dass es mit alternativen Enzymen m\u00f6glich ist, h\u00f6here L-Glu-Konzentrationen von 100 mM und h\u00f6her vollst\u00e4ndig zu Ketoglutarat umzusetzen. Erg\u00e4nzend wurde ein weiterer Synthesezugang zu ?-Ketoglutarat untersucht. Hierbei konnte ein Herstellungsverfahren f\u00fcr diese Ketos\u00e4ure erfolgreich entwickelt werden, zudem gegenw\u00e4rtig eine Patentierung vorbereitet wird.
\nVerfahrenstechnik (teilprojekt\u00fcbergreifend)
\nUniversit\u00e4t Rostock (UR, Prof. Kragl)
\nIn Teilprojekt II best\u00e4tigt das O2-Sensor-Screening eine sehr geringe Halbwertszeit der isolierten trans-P4H und eine starke Beeinflussung des Gel\u00f6stsauerstoffgehaltes durch FeSO4-Zus\u00e4tze. Angesichts der aufwendigen Isolierung und anschlie\u00dfende Aufreinigung des Zielproduktes in sehr verd\u00fcnnter L\u00f6sung (Ums\u00e4tze von 0,2 g\/L, in Einzelf\u00e4llen auch bis zu 0,5 g\/L) lie\u00dfen sich weder in vitro noch in vivo vertretbare Methoden f\u00fcr den technischen Ma\u00dfstab finden.
\nIn Teilprojekt I wurden in der AG Kragl verschiedene Aufarbeitungsvarianten (diskontinuierlich\/kontinuierlich) f\u00fcr ?-Caprolacton untersucht. Die Schwerpunkte lagen zum einen in der Extraktion des Zielproduktes aus einer w\u00e4ssrigen Fermentationsbr\u00fche und zum anderen in der Auswahl und dem Re-cycling geeigneter Adsorber f\u00fcr das SFPR-Konzept zu Realisierung des 0,1-1 kg Ma\u00dfstabes.
\nTechnische Universit\u00e4t Dortmund (TUD, Prof. Schmid)
\nZur kontinuierlichen Umsetzung von Cyclohexan zu Cyclohexanol wurden die Alkanmonooxygenase (AlkBGT) aus P. putida GPO1, sowie die Cytochrom P450 CypP153A6 aus Mycobacterium sp. Strain HXN-1500 eingesetzt. Beide Enzymsysteme wurden auf “broad-host-range” Vektoren kloniert, welche sowohl in Pseudomonaden als auch in E. coli erkannt werden. Als Wirtsst\u00e4mme kamen rekombinante Biofilme aus Pseudomonas VLB120 (alkBGT) und Pseudomonas KT2440 (cyp156A6) in kapillaren Mikroreaktoren zum Einsatz. Obgleich die volumetrischen Aktivit\u00e4ten relativ niedrig sind (zwischen 3 und 5 U\/L), wurde kontinuierlich \u00fcber 25 Tage Cyclohexanol produziert.
\nTechnische Universit\u00e4t Hamburg-Harburg (TUHH, Prof. Liese)
\nEs konnte gezeigt werden, dass sich auf Basis der Reaktion von cyclischen Ketonen mit einer Cyclohe-xan-Monooxygenase stereoselektiv verschiedene ungew\u00f6hnliche Lactone mit ee-Werten von bis zu 80% erhalten lassen, die bei Kopplung mit einer Hydrolase-Spaltung zu pharmakologisch interessanten Wirkstoffen f\u00fchren. Wesentliche Problematik und damit Schl\u00fcssel zum Erfolg im Rahmen dieser Zielsetzung war die Entwicklung eines Reaktorkonzeptes zur optimalen Begasung der CHMO unter Ber\u00fccksichtigung gleichzeitig destabilisierender Effekte von Sauerstoff auf das Enzymsystem. Diesbez\u00fcglich konnte ein Membranbegasungs-Reaktor entwickelt werden, der f\u00fcr die CHMO-Katalyse eine um den Faktor zehn verbesserte Raum-Zeit-Ausbeute erlaubte. Hieraus resultierte ein Membranreaktor, der deutlich leistungsf\u00e4higer als alle bisherigen Konzepte war. Prinzipiell handelte es sich bei diesen Ergebnissen um allgemeing\u00fcltige Erkenntnisse, die auch auf andere enzymatische Oxidationsreaktionen \u00fcbertragbar sein sollten und damit weit reichenden Zusatznutzen f\u00fcr den Einsatz von Enzymen nicht nur im Rahmen der Baeyer-Villiger-Oxidation haben.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
ESBES, 2012, Istanbul, T\u00fcrkei; Vortrag R. Karande (TUD) Segmented flow biofilm microreactors.
\nBioverfahrenstechnik an Grenzfl\u00e4chen, 2011, Potsdam; Vortrag R. Karande Segmented flow capillary microreactors: a tool for bio-process intensification.
\nBiotrends, 2011, Poster R. Karande Applications of segmented flow microreactor for biocatalysis, Dortmund
\nBiotrans 2011, Sizilien, Italy; Poster Christina A. M\u00fcller Reengineering P450 BM-3 monooxygenase for industrial applications: production of bulk chemicals.
\nBiocat 2012, Hamburg; Poster Christina A. M\u00fcller Enzyme-coupled cofactor regeneration during double-oxidation of alkanes in one-pot.
\nBiotechnica 2011, Hannover, Vortrag Behrendt D. Diversity for Proteins<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
W\u00e4hrend der Projektlaufzeit ist es allen Partnern im Konsortium gelungen, die wesentlichen Projektziele und die Meilensteine gem\u00e4\u00df Planung zu erreichen. Die verschiedenen Reaktionssysteme konnten erfolgreich grundlegend etabliert werden und es konnte f\u00fcr alle geplanten Biokatalysen gezeigt werden, dass die gew\u00fcnschten Reaktionsprodukte gebildet werden. In den meisten F\u00e4llen konnte dies auch in pr\u00e4parativen Ans\u00e4tzen best\u00e4tigt werden. Parallel dazu wurden f\u00fcr die verschiedenen Plattformen (Enzymherstellung, Assaysysteme, Reaktionssysteme usw.) wesentliche Fortschritte erzielt. Der Austausch von Enzymproben bzw. Substraten und des Know-hows zwischen den Verbundpartnern erfolgte nach Plan.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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