Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Diterpene wie Abietins\u00e4ure werden in Nadelb\u00e4umen als Verteidigungsstoffe gegen Sch\u00e4dlinge wie Insekten, Pilze etc. gebildet. Dar\u00fcber hinaus haben sie biotechnologische Bedeutung als Synthons f\u00fcr die Synthese biologisch aktiver Naturstoffe sowie als therapeutisch wirksame Substanzen (antibakteriell, antiviral). Das Projekt soll (1) die M\u00f6glichkeiten der Umsetzung von Abietins\u00e4ure und seiner Analoga und Derivate mit dem Enzym CYP106A2 untersuchen; (2) die gebildeten Produkte charakterisieren und (3) die Anwendbarkeit der Umsetzungen bzw. Produkte f\u00fcr umweltschonende biotechnologische Verfahren pr\u00fcfen. Bisherige chemische Verfahren beschreiben f\u00fcr die Hydroxylierung der Abietins\u00e4ure den Einsatz des hochgiftigen OsO4 als Katalysator. Der Einsatz einer enzymatischen Reaktion w\u00e4re daher viel umweltschonender.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie Arbeitsschritte beinhalten die folgenden Aufgaben und zu verwendenden Methoden:
\n1)\tHerstellung einer ausreichenden Menge der durch CYP106A2 umgesetzten Abietins\u00e4ure und Aufkl\u00e4rung der Struktur des Produkts.
\n2)\tEtablierung der Methodik f\u00fcr die Identifizierung des Produktes\/der Produkte.
\n\tHier muss untersucht werden, inwieweit HPLC und MS f\u00fcr die Identifizierung ausreichend sind oder ob NMR-Analysen notwendig werden. Die Entscheidung h\u00e4ngt u. a. von der Frage ab, welche Derivate als Standards erh\u00e4ltlich sind.
\n3)\tHerstellung einer ausreichenden Menge der durch CYP106A2 umgesetzten Abietins\u00e4ure-Analoga und Aufkl\u00e4rung der Struktur der Produkte.
\n4)\tEinsatz von aktiven CYP106A2-Mutanten zur Synthese von Abietins\u00e4ure-Derivaten mit ge\u00e4nderter Hydroxylierungsselektivit\u00e4t im Vergleich zum Wildtyp-CYP106A2.
\n5)\tAnalyse potenzieller Anwendungsm\u00f6glichkeiten der Produkte in der Biotechnologie.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Das in vitro-Screening der Terpenoid-Bibliothek mit CYP106A2 ergab, dass insgesamt 24 Diterpenoide von dem Enzym umgesetzt werden k\u00f6nnen. Dar\u00fcber hinaus konnte der Umsatz von Abietins\u00e4ure sowie 15 weiterer Diterpenoide durch das bakterielle CYP105A1 aus Streptomyces griseolus nachgewiesen werden.
\nDie Etablierung eines Protokolls f\u00fcr den in vivo Umsatz von Abietins\u00e4ure in Bacillus megaterium war erfolgreich und die Reaktionsprodukte konnten nach ihrer Isolierung und Reinigung mittels NMR identifiziert werden. Die so gezeigte regioselektive allylische Hydroxylierung der Abietins\u00e4ure durch CYP106A2 ist sehr interessant, da sie \u00fcber herk\u00f6mmliche organische Synthese nur schwer bewerkstelligt werden kann. So werden f\u00fcr die allylische Hydroxylierung von Terpenen unter anderem Methoden unter Verwendung von Selendioxid beschrieben, welche jedoch auf Grund der m\u00f6glichen Bildung von sehr giftigen Organoselenverbindungen recht problematisch sind.
\nF\u00fcr den Abietins\u00e4ure-Umsatz mit CYP105A1 wurde ein weiteres Ganzzellsystem in Escherichia coli entwickelt. Auch dieses System erm\u00f6glichte die Herstellung des Reaktionsproduktes von Abietins\u00e4ure mit CYP105A1 in ausreichendem Ma\u00dfe f\u00fcr eine anschlie\u00dfende Strukturaufkl\u00e4rung mittels NMR. Es konnte gezeigt werden, dass es sich bei dem Produkt um 15-Hydroxyabietins\u00e4ure handelt. Dies ist insofern sehr interessant, als dass ein sehr \u00e4hnliches Oxidationsprodukt der Abietins\u00e4ure, die 15 Hydroperoxyabietins\u00e4ure (15-HPA), vor einiger Zeit als das Hauptallergen von Kolophonium identifiziert wurde. Da Kolophonium in einem breiten Spektrum von Produkten des t\u00e4glichen Lebens vorhanden ist und dessen Hautunvertr\u00e4glichkeit zu den f\u00fcnf h\u00e4ufigsten Kontaktallergien geh\u00f6rt, besteht ein gro\u00dfes Interesse an diesem Molek\u00fcl. Der von uns gezeigte Umsatz durch das bakterielle Cytochrom P450 in Kombination mit anschlie\u00dfender Reaktion zum 15-Hydroperoxid ist somit eine ernstzunehmende Alternative f\u00fcr die Herstellung dieser interessanten Substanz.
\nDes Weiteren wurden Untersuchungen \u00fcber die strukturellen Grundlagen der Substratbindung von Diterpenoiden durch CYP105A1 und CYP106A2 angestellt. In diesem Zusammenhang wurden erste Screening-Experimente zur Kristallisation der beiden Enzyme durchgef\u00fchrt. Aus beiden Proteinen konnten erfolgreich Proteinkristalle gez\u00fcchtet werden, was einen wesentlichen Schritt auf dem Weg zur Strukturaufkl\u00e4rung bedeutet.
\nInsbesondere durch die Entwicklung der potenten Ganzzellsysteme f\u00fcr die Biotransformation der Substrate in Bacillus megaterium und Escherichia coli wurde eine hervorragende Ausgangslage f\u00fcr die Untersuchung weiterer potentieller Substrate der bakteriellen Cytochrome geschaffen. Dar\u00fcber hinaus sollte in weiterf\u00fchrenden Arbeiten untersucht werden, in wieweit sich die Enzyme bzw. die Ganzzellsysteme zur Detoxifikation eignen, denn gro\u00dfe Mengen von Harzs\u00e4uren stellen auf Grund ihrer Toxizit\u00e4t nach wie vor ein gro\u00dfes Problem f\u00fcr Gew\u00e4sser, insbesondere durch Einleitung von Abw\u00e4ssern der Papier- und Zellstoffverarbeitenden Industrie, dar.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Teile der Projektergebnisse wurden auf der 17th International Conference on Cytochrome P450 vorgestellt. Es entstand au\u00dferdem eine Publikation, welche in ChemBioChem ver\u00f6ffentlicht wurde. Eine weitere Publikation befindet sich in der Vorbereitung.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Im Rahmen des Projektes wurden mehrere neue Substrate aus der Klasse der Diterpenoide f\u00fcr das CYP106A2 nachgewiesen. Dar\u00fcber hinaus konnte gezeigt werden, dass das bakterielle CYP105A1 ebenfalls in der Lage ist, die Abietins\u00e4ure sowie eine Reihe weiterer Diterpenoide umzusetzen. Um ge-nauere Untersuchungen der Produkte durchf\u00fchren zu k\u00f6nnen, wurden zwei effiziente Ganzzellsysteme f\u00fcr Bacillus megaterium bzw. Escherichia coli mit relativ hoher Produktausbeute entwickelt. Die Analyse der Produkte zeigte, dass es sich um f\u00fcr die Allergieforschung relevante Substanzen handelt, die auf chemischem Wege nur sehr schwer zu synthetisieren sind. Die entwickelten Ganzzellsysteme stellen somit nicht nur eine kosteng\u00fcnstigere und schnellere, sondern auch \u00f6kologisch deutlich bessere Alternative zur Herstellung dieser Substanzen dar.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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