Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Anlass des vorliegenden Verbundvorhabens waren extrazellul\u00e4re unspezifische Peroxygenasen aus Basidiomyceten, welche bisher kommerziell noch nicht verf\u00fcgbar sind.
\nDie spektroskopischen und katalytischen Besonderheiten dieser Enzyme lassen eine Zwischenstellung (missing link) zwischen H\u00e4m-Thiolat-Haloperoxidasen und Cytochrom-P450 Monooxygenasen (Hydroxylasen) vermuten und zuk\u00fcnftig eine hohe biotechnologisch-industrielle Bedeutung prognostizieren. Obgleich eine Reihe biotechnologisch interessanter Enzyme, die industriell relevante Oxygenierungen katalysieren existiert, k\u00f6nnen diese bisher aufgrund ihres intrazellul\u00e4ren Vorkommens und komplexer Anforderungen an Kosubstrate und Hilfsproteine technisch noch nicht eingesetzt werden oder nur als Ganzzell-Katalysatoren fungieren. Im Rahmen des Vorhabens sollten Peroxygenasepr\u00e4parate in ausreichenden Mengen f\u00fcr die Anwendung in der Biokatalyse zur Verf\u00fcgung gestellt werden. Dies beinhaltete sowohl die Enzymgewinnung durch Wildstamm-Kultivierung, als auch M\u00f6glichkeiten zur heterologen Expression von Peroxygenasen.
\nZiel war es, das regio- und enantioselektive Katalysepotenzial f\u00fcr industrielle Verfahren am Beispiel
\nder stereoselektiven Oxyfunktionalisierung von Ethylbenzol zu (R)-1-Phenylethanol (einem chiralen Auxiliar f\u00fcr die chemische Industrie und Ausgangsstoff f\u00fcr Duft- und Kosmetikprodukte) und der regioselektiven Hydroxylierung von Propranolol zu 5-Hydroxypropranolol (einem humanen first pass Lebermetaboliten, der f\u00fcr pharmakologische Untersuchungen ben\u00f6tigt wird) zu ermitteln. Die entwickelten Verfahren wurden projektbegleitend \u00fcber \u00d6koeffizienzanalysen mit bekannten chemischen und biotechnischen Verfahren verglichen und entsprechend weiterentwickelt.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenMittels Submerskultivierung und Fermentation wurden peroxygenasehaltige Rohenzymextrakte von Agrocybe aegarita und Coprinellus radians gewonnen, \u00fcber FPLC-S\u00e4ulen gereinigt und f\u00fcr die enantioselektive Synthese von (R)-1-Phenylethanol sowie f\u00fcr die regioselektive Synthese von 5-Hydroxypropranolol (als Ersatz zu 7-Hydroxymethotrexat) eingesetzt. Beide Produkte wurden selektiv durch einstufige Hydroxylierungsreaktionen aus Ethylbenzen beziehungsweise Propranolol unter Einsatz von Wasserstoffperoxid als molares Kosubstrat hergestellt. Im Mittelpunkt der enzymkatalysierten Synthesen im analytischen Ma\u00dfstab standen dabei die Einfl\u00fcsse variabler Reaktionsparameter in Bezug auf maximale Produktausbeute, Enantiomerenverh\u00e4ltnis sowie die Bildung von Nebenprodukten. Parallel dazu wurde die Enzymkatalyse zur quantitativen Darstellung von 5-Hydroxypropranolol und (R)-1-Phenylethanol unter Produktisolation und Substratr\u00fcckgewinnung etabliert. Die Analyse der entstandenen Produkte erfolgte mittels HPLC, GC-MS und D\u00fcnnschichtchromatographie. Auf der Grundlage von ermittelten Sequenzdaten zum AaP-Gen (entspr. E. coli-Klone) und zur AaP-Aminos\u00e4uresequenz (peptide mapping, N-termini, etc.) sollten diese Peroxygenasen weiterhin heterolog produziert werden.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Innerhalb des abgeschlossenen Verbundvorhabens konnten pilzliche Peroxygenasen aus Agrocybe aegeritaund Coprinellus radians erstmalig als zellfreie, selektiv oxyfunktionalisierende Enzymsysteme industriell verf\u00fcgbar gemacht werden. F\u00fcr die eingesetzten Modellsubstanzen ((R)-1-Phenylethanol und 5-Hydroxypropranolol) konnte mit den beschriebenen Peroxygenase-Verfahren ein v\u00f6llig neuer L\u00f6sungsansatz zur Herstellung und Gewinnung dieser Verbindungen aufgezeigt werden. Die ermittelten Umweltbewertungszahlen sind bei beiden Peroxygenase-Verfahren gleichwertig oder deutlich besser als bisherige chemische oder biotechnologische Verfahren. \u00c4nderungen in der Zielsetzung wurden insoweit notwendig, da nach Umsetzung von Methotrexat nicht der gew\u00fcnschte Metabolit 7-Hydroxymethotrexat identifiziert werden konnte. Bedingt dadurch wurde diese Modellverbindung durch Propranolol ersetzt. Die Herstellung der homolog exprimierten Enzyme konnte erfolgreich bis in den 30 l Ma\u00dfstab \u00fcberf\u00fchrt werden. Die heterologe Expression der pilzlichen Peroxygenasen konnte durch die Expression zweier Peroxygenasen aus Coprinus cinereus gel\u00f6st werden. Die in diesem Projekt hergestellten und charakterisierten Peroxygenasen sind hinsichtlich ihres Spektrums an nachhaltigen Oxyfunktionalisierungsreaktionen, ihrer einfachen Handhabbarkeit und Effizienz als sehr innovativ einzustufen. Auf Basis der umfangreich publizierten Ergebnisse und der entwickelten Methoden und Verfahren werden weiterf\u00fchrende Untersuchungen u.a. in einem BMBF- unterst\u00fctzten Forschungs- und Entwicklungskooperationsverbund durchgef\u00fchrt.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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