Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Es sollte ein innovatives biotechnologisches Verfahren zur Produktion von Isotopen-markierten Metaboliten-Referenzstandards etabliert werden, das auf einer Cytochrom P450-abh\u00e4ngigen Biotransformation beruht. Als Mikroorganismus f\u00fcr diese Biotransformation sowie f\u00fcr die Cortisolproduktion wurden rekombinante Spalthefen (Schizosaccharomyces pombe) eingesetzt, die die relevanten humanen Cytochrom P450-Enzyme (und ihre Hilfsproteine) exprimieren. Eine optimierte prozesstechnische Verfahrensf\u00fchrung im Bioreaktor soll im Vergleich zu den bisher eingesetzten chemischen Herstellungsverfahren umweltgerechtere, Ressourcen-schonendere und rentablere Prozesse erlauben.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie Projektpartner vereinen ihre nachgewiesene Expertise im Bereich der P450-Enzyme (Prof. R. Bernhardt), der P450-abh\u00e4ngigen Biotransformation mit rekombinanten Spalthefen (PomBioTech GmbH) sowie der Prozessentwicklung und -optimierung (Dr. S. L\u00fctz, Prof. C. Lang), um ein \u00f6konomisch tragf\u00e4higes und \u00f6kologisch sinnvolles Produktionsverfahren f\u00fcr literaturbekannte Cytochrom P450-Referenzstandards (z. B. 6\u00df-Hydroxytestosteron, 3-Hydroxyibuprofen, 4-Hydroxydiclofenac) zu entwickeln, die mit nicht-radioaktiven Isotopen markiert sind.
\nDie Aufgaben der AG Bernhardt umfassen Molekularbiologische Erzeugung von cDNAs f\u00fcr P450-Enzyme mit erh\u00f6hter Aktivit\u00e4t durch Mutagenese sowie die Entwicklung eines Roboter-gest\u00fctzten Screening-Verfahrens zur schnellen Testung der P450-Aktivit\u00e4t. Die Aufgaben der PomBioTech GmbH beinhalten die Produktion der Zielsubstanzen mit bereits vorhandenen Spalthefest\u00e4mmen im Laborma\u00dfstab, die Klonierung von neuen Spalthefest\u00e4mmen sowie die Testung der neuen St\u00e4mme der von der AG Bernhardt entwickelten Enzyme im Laborma\u00dfstab. Die Aufgaben des IBT 2 (dieser Projektpartner ist zum Juni 2009 aus dem Verbund ausgeschieden, als neuer Partner konnte daf\u00fcr die Organobalance GmbH gewonnen werden) bzw. der Organobalance GmbH waren die Prozessentwicklung und -optimierung der vorhandenen Verfahren unter Verwendung der von der PomBioTech zur Verf\u00fcgung gestellten Spalthefest\u00e4mme.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Um eine effiziente und umweltgerechte Herstellung von Metaboliten zu erreichen, wurden im Rahmen des Projekts drei Cytochrom P450-Enzyme molekularbiologisch optimiert und untersucht. Dazu wurde erfolgreich ein Roboter-unterst\u00fctztes Durchmusterungsverfahren f\u00fcr die molekularbiologische Optimierung von Cytochrom P450 Enzymen in Hefen entwickelt und verwendet. Eine solche Durchmusterung im Ganzzell-Hefesystem ist sehr anspruchsvoll und konnte bislang international nur in wenigen F\u00e4llen demonstriert werden. Desweiteren wurde ein neues Verfahren f\u00fcr die Plasmidisolierung aus Spalthefen entwickelt und erfolgreich genutzt. Ca. 3000 Hefe Klone wurden mit Hilfe der HPLC analysiert. Dabei konnten zwei CYP3A7- und drei CYP11B2-Mutanten mit gesteigerten Enzymaktivit\u00e4ten identifiziert wer-den. Basierend auf diesen Ergebnissen konnte weiterhin ein Roboter-unterst\u00fctztes Durchmusterungsverfahren f\u00fcr die Untersuchung der Wechselwirkung von Fremdstoffen mit dem Leber Cytochrom CYP3A4 entwickelt und erfolgreich eingesetzt werden.
\nAufbauend u. a. auf diesen Ergebnissen konnte die Produktion einer ganzen Reihe von P450-Metaboliten (wie z. B. 6\u00df-Hydroxytestosteron, Sorafenib N-Oxid und 3-Hydroxyibuprofen) gezeigt werden, und zwar sowohl von unmarkierten Metaboliten als auch von solchen, die mit stabilen Isotopen markiert sind. Der Produktionsma\u00dfstab reichte hierbei bis zur Gr\u00f6\u00dfenordnung von 5 g, was in Anbe-tracht der hochpreisigen Verbindungen als durchaus nennenswert zu bezeichnen ist. Zur Optimierung der Ganzzell-Biotransformation wurde unter anderem das sog. Design of Experiment (DoE) eingesetzt. Weiterhin erfolgte eine Erweiterung des zur Verf\u00fcgung stehenden Spektrums an CYP-Enzymen; neben der Expression zus\u00e4tzlicher humaner CYP-Isoenzyme konnten zudem durch die Kombination aktivierter polymorpher Varianten bei den Vertretern der CYP3A-Familie zum Teil erhebliche Umsatzsteigerungen erreicht werden. Alle diese positiven Resultate erm\u00f6glichen jetzt eine effiziente und umweltgerechte Herstellung ausgew\u00e4hlter Isotopen-markierten Metaboliten-Referenzstandards.
\nWas die Optimierung des Prozesses der Cortisolherstellung aus 11-Deoxycortisol mittels Ganzzell-Biotransformation angeht, so l\u00e4sst sich festhalten, dass eine signifikante Steigerung der Cortisolbildungsrate erreicht werden konnte. Stellt man einen Vergleich zwischen den Cortisolkonzentrationen im nicht optimierten Prozess und im optimierten Prozess an, so konnte der Prozess nur mit der Optimierung der Biomasse und Substratmenge im Biotransformationsansatz um den Faktor 13 verbessert werden. Bei der Zusammenf\u00fchrung aller einzelnen Optimierungsergebnisse (z.B. der Einsatz von 2 % (v\/v) Saccharose im Assay und 0,1 % (v\/v) Tween80 vor und w\u00e4hrend der Biotransformation, die Verwendung von Zellen aus der station\u00e4ren Wachstumsphase) ist zu erwarten, dass eine noch h\u00f6here Steigerung der Ausbeute zu erzielen ist. Der Prozess der Biotransformation mithilfe des S. pombe Stammes SZ1 von 11-Deoxycortisol zu Cortisol konnte somit stark verbessert werden, wodurch die Wirtschaftlichkeit und \u00d6koeffizienz des gesamten Prozesses gesteigert wird. Wie die durchgef\u00fchrte \u00d6koeffizienzanalyse ergab, konnte durch die Prozessoptimierung bei der Cortisolproduktion aus \u00f6kologischer Sicht eine klare Verbesserung um einen Faktor von ca. 40 erreicht werde. Jedoch ist beim bisher erreichten Entwicklungsstand die Produktqualit\u00e4t (bedingt durch den geringen Umsatz und die schwierige Abtrennung des chemisch \u00e4hnlichen Edukts) noch nicht ausreichend, so dass hier weitere Arbeiten erforderlich sind, um den Prozess konkurrenzf\u00e4hig zu gestalten. Aus den bisherigen Arbeiten ergeben sich daf\u00fcr zahlreiche Ansatzpunkte.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Am 3.9.2008 wurde eine Pressemitteilung mit dem Titel Eine halbe Million Euro f\u00fcr effizientere biotech-nologische Produktionsverfahren von der Universit\u00e4t des Saarlandes ver\u00f6ffentlicht. Weiterhin wurde Tei-le der Projektergebnisse auf 5 internationalen Kongressen vorgestellt. Es entstanden bis jetzt f\u00fcnf Publikationen, drei weitere befinden sich in Vorbereitung. Au\u00dferdem wurde ein Beitrag f\u00fcr BioChemTech Reviews erstellt und publiziert.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Es wurden neue Verfahren entwickelt (durch ortsgerichtete Mutagenese bzw. gerichtete Evolution von Cytochromen P450 und Nutzung der verbesserten Proteine in einem Spalthefe-Ganzzellsystem), die eine effizientere Produktion von Arzneimittelmetaboliten f\u00fcr die Produktion von Isotopen-markierten Referenzstandards erlauben. Weiterhin konnte die Cortisolproduktion durch Prozessoptimierung aus \u00f6kologi-scher Sicht um den Faktor 40 verbessert werden.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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